实验六高效液相色谱法优秀课件
合集下载
第五章高效液相色谱法6hppt课件-PPT精品文档
四、检 测 器 高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件 (高压输液泵、色 谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓 度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一 个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所 有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不 敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。 可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。 常用的检测器为紫外吸收检测器 (UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。 在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 高，即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等 ) ，又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。
（二）柱连接方式 柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结 材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让 流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦 应愈小愈好，一般常用窄孔 (内径0.13mm)的厚壁(1.5— 2.0mm)不锈钢管，以减少柱 外死体积。所用柱接头，联 接螺帽，密封圈及色谱柱接 头皆为不锈钢材料。
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
定性分析用高效液相色谱法确定未知样中的成分课件
液相色谱仪工作原理图
三． 仪器和试剂：
1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2． 色谱柱：C18 3． 超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4． 注射器：50微升
5． 流动相： 80%甲醇+20%的水，制备 前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5， 进入系统色谱前，用超声波发生器或水 泵脱气。
3、哪些条件会影响浓度测定值的准确性？
4.、为什么流动相和样品要进行脱气，否 则会产生什么影响？
注意:
关机前，用过缓冲盐溶液必须先用100% 的水冲洗系统（打开排液阀，调流速为 5ml/min，冲洗约5 min，然后调流速为 1ml/min，待流速降下来后，关闭排液阀， 再冲洗冲洗约20 min）；
在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决 于它们在固定相和流动相中的分配系数K：
K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流
动相中的浓度）
显然，K值越大，组分在固定相上的停留时间 越长，容易理解：溶质流经色谱柱时，K值越大停 留的时间也越长，K值越小，停留的时间也越短， 当组分在固定相的K不同，就会出现差速迁移，从 而达到分离的目的。
一． 实验目的：
1． 学习高效液相色谱仪的基本操作方法；
2． 学习用高效液相色谱法确定未知样中的 组分，掌握采用高效液相色谱法对物质进行定性分析。
二． 实验原理：
液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分， 由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子 交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在 两相间进行反复多次（103～106次）地分配过程，使 得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留 能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动 速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开 来：
高效液相色谱法 (HPLC)ppt课件
Chromatography)
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
31
精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
31
精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
高效液相色谱法ppt
3、操作条件差别 GC:加温操作 HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小)
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
续前
四、HPLC得特点与应用
“三高” “一快” “一广”
高柱效——n=104片/米,柱效高(远高于一般LC) 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛(可分析80%有机化合物)
第二节 基本理论与条件选择
热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件得选择
基础
一、塔板理论
第四节 影响分离得因素
1、R n 1 k2
4 1 k2
H A C u n ：采用粒度小、填充均匀的固定相
采用粘度小、低流速的流动相
K2
k2
t
' R2
V
' R2
K1
k1
t
' R1
V
' R1
：调整流动相种类、性质和固定相性质（受柱温影响小）
k Ws
CsVs
K Vs
t
' R
1、分离机制:疏溶剂理论
正相——流动相与溶质排斥力强,作用时间↑
k↑,组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱,作用时间↓,
2、固定相:极性小得烷基键合相
k↓,组分tR↓
C8柱,C18柱(ODS柱——HPLC约80%问题) 3、流动相:极性大得甲醇-水或乙腈-水
流动相极性 > 固定相极性
底剂 + 有机调节剂(极性调节剂)
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
续前
四、HPLC得特点与应用
“三高” “一快” “一广”
高柱效——n=104片/米,柱效高(远高于一般LC) 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛(可分析80%有机化合物)
第二节 基本理论与条件选择
热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件得选择
基础
一、塔板理论
第四节 影响分离得因素
1、R n 1 k2
4 1 k2
H A C u n ：采用粒度小、填充均匀的固定相
采用粘度小、低流速的流动相
K2
k2
t
' R2
V
' R2
K1
k1
t
' R1
V
' R1
：调整流动相种类、性质和固定相性质（受柱温影响小）
k Ws
CsVs
K Vs
t
' R
1、分离机制:疏溶剂理论
正相——流动相与溶质排斥力强,作用时间↑
k↑,组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱,作用时间↓,
2、固定相:极性小得烷基键合相
k↓,组分tR↓
C8柱,C18柱(ODS柱——HPLC约80%问题) 3、流动相:极性大得甲醇-水或乙腈-水
流动相极性 > 固定相极性
底剂 + 有机调节剂(极性调节剂)
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
HPLC示意图
20.2. 高效液相色谱仪
20.2.1.流动相贮器和溶剂处理系统
现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器， 一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚 醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积 500~2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的 输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中 微量气体通过放空阀排出。
20.2.2.高压泵系统
通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50500)×105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流 速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系 统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压 泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性 极小。最重要的是系统密封性能好。
20.2.5.液相色谱检测器
l. 光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极 管阵列检测器，红外吸收检测器 2. 荧光检测器 3. 示差折光率检测器 4. 蒸发光散射检测器 5. 电化学检测器
20.3.高效液相色谱固定相和流动相
20.3.1. 高效液相色谱固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，
储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置， 这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测 器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌 下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气 体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处 装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣， 防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。
上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方 法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各 色谱方法在相关领域应用互相补充。
20.2. 高效液相色谱仪
现代高效液相色谱使用3~10μm柱填料，为达到 适用的流动相流速，高压泵需提供几十MPa或数百大 气压力的柱前压。因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪 要复杂和昂贵。
目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞 泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。
往复柱塞泵
1.电机，2.往复凸轮，3.密封柱 塞，4.吸排液单向阀，5.溶剂入 口，6.脉动阻尼器,7.接色谱柱。
20.2.3.进样系统
进 样 阀
六口旋转进样阀示意图
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约 5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较 突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的 峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展 宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因 此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。
需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作 用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。
根据固定相和液体流动相相对极性 的差别，有正相色谱和反相色谱两种色 谱体系或方法。
反相色谱和正相色谱主要区别是流 动相和固定相的相对极性，最初形成于 液液分配色谱，现已广泛应用于其他各 种色谱方法。
20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系
对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留 值和更好分离色谱图。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
20.2.5.液相色谱检测器
在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。
20.2.4.高效液相色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定 相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管 用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝 胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以 上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为 其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中 固定相，保证分离的性能不受影响。
适用范围广
20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系
1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 4. 体积排阻色谱(size Exclusion Chromatography)
新型分离模式和 方法不断增加
高度均匀甚至单分 散1~3μm硅胶基质 球形填料，达15~30 万理论塔板/m。
20.1.2.高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较
基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度、高选择性 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性
操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力
可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化 硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压， 可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二 氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可 扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚 苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面 多孔型和全多孔型固定相两类。
实验六高效液相色 谱法
20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展
高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世， 导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。
薄壳型填料，柱效 仅每米1000~3000 塔板数
5~10μm球型和无定 型微粒硅胶，每米 5~6万理论塔板数
20.2.4.高效液相色谱柱
1.色谱柱类型
按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半 制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。
2.保护柱
一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除 去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中 含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的 分析柱，延长使用寿命。
3.柱恒温器
20.2. 高效液相色谱仪
20.2.1.流动相贮器和溶剂处理系统
现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器， 一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚 醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积 500~2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的 输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中 微量气体通过放空阀排出。
20.2.2.高压泵系统
通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50500)×105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流 速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系 统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压 泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性 极小。最重要的是系统密封性能好。
20.2.5.液相色谱检测器
l. 光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极 管阵列检测器，红外吸收检测器 2. 荧光检测器 3. 示差折光率检测器 4. 蒸发光散射检测器 5. 电化学检测器
20.3.高效液相色谱固定相和流动相
20.3.1. 高效液相色谱固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，
储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置， 这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测 器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌 下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气 体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处 装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣， 防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。
上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方 法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各 色谱方法在相关领域应用互相补充。
20.2. 高效液相色谱仪
现代高效液相色谱使用3~10μm柱填料，为达到 适用的流动相流速，高压泵需提供几十MPa或数百大 气压力的柱前压。因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪 要复杂和昂贵。
目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞 泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。
往复柱塞泵
1.电机，2.往复凸轮，3.密封柱 塞，4.吸排液单向阀，5.溶剂入 口，6.脉动阻尼器,7.接色谱柱。
20.2.3.进样系统
进 样 阀
六口旋转进样阀示意图
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约 5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较 突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的 峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展 宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因 此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。
需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作 用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。
根据固定相和液体流动相相对极性 的差别，有正相色谱和反相色谱两种色 谱体系或方法。
反相色谱和正相色谱主要区别是流 动相和固定相的相对极性，最初形成于 液液分配色谱，现已广泛应用于其他各 种色谱方法。
20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系
对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留 值和更好分离色谱图。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
20.2.5.液相色谱检测器
在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。
20.2.4.高效液相色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定 相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管 用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝 胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以 上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为 其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中 固定相，保证分离的性能不受影响。
适用范围广
20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系
1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 4. 体积排阻色谱(size Exclusion Chromatography)
新型分离模式和 方法不断增加
高度均匀甚至单分 散1~3μm硅胶基质 球形填料，达15~30 万理论塔板/m。
20.1.2.高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较
基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度、高选择性 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性
操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力
可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化 硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压， 可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二 氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可 扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚 苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面 多孔型和全多孔型固定相两类。
实验六高效液相色 谱法
20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展
高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世， 导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。
薄壳型填料，柱效 仅每米1000~3000 塔板数
5~10μm球型和无定 型微粒硅胶，每米 5~6万理论塔板数
20.2.4.高效液相色谱柱
1.色谱柱类型
按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半 制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。
2.保护柱
一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除 去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中 含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的 分析柱，延长使用寿命。
3.柱恒温器