第六章固定化酶
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酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
《酶的固定化》PPT课件
第一节 酶固定化
定义 酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程; 固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 进行反应，反应后的酶可回收重复使用; 概念发展
“水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme)
1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobi lized enzyme)”
• 1、吸附法(link) • 2、包埋法(link) • 3、结合法(link) • 4、交联法(link) • 5、热处理法(link)
酶固定化方法示意图
吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法; 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.
(2)产物酸碱性对最适pH值的影响
酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高 碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低 中性:固定化酶的最适pH值一般不变 原因:载体障碍产物的扩散
(back)
底物的特异性
与底物分子量的大小有关; 作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基 酰化酶、葡聚糖氧化酶等; 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的 酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上 的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对 酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右 原因:载体的空间位阻作用
Relative activity (%)
100
80
60
A
B 40
20
0 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( 篊 )
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
食品化学-06酶
（2）酸处理法 ） • 多数酚酶最适 ＝6～7，PH < 3失活。 多数酚酶最适PH＝ ～ ， 失活。 失活 • 常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。 常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。 • 柠檬酸可降低 ，还可络合酚酶辅基 2+，但单独用效果不大。常 柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基Cu 但单独用效果不大。 与抗坏血酸、亚硫酸合用。 与抗坏血酸、亚硫酸合用。 • 实践证明：0.5%柠檬酸 + 0.3%抗坏血酸效果好。 实践证明： 抗坏血酸效果好。 柠檬酸 抗坏血酸效果好 • 抗坏血酸还可使酚酶失活，且可耗氧。 抗坏血酸还可使酚酶失活，且可耗氧。
5
酶的固定方法 2. 共价连接
利用酶与载体形成共价键固定酶 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 形成共价键的反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化， 形成共价键的反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化，因 此酶活力回收一般较低。 此酶活力回收一般较低。 共价结合法使用的载体主要有： 共价结合法使用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素及其衍生物、 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素及其衍生物、氨基酸 共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。 共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。
17
b．钙离子激活中性蛋白酶 分离出两种：CANPⅠ和CANPⅡ 分离出两种：CANPⅠ和CANPⅡ 都是二聚体 都是二聚体 含有相同的较小亚基（MW=30,000）和较大的亚基（MW=80,000， 含有相同的较小亚基（MW=30,000）和较大的亚基（MW=80,000，免疫性 质不同）。 ）。 质不同）。 完全激活：50～ μmol/L CANP I 完全激活：50～100 μmol/L Ca2+ 的激活： mmol/L CANP II 的激活：1～2 mmol/L Ca2+ 活性部位中含有半胱氨酸残基的巯基，被归属于巯基蛋白酶 活性部位中含有半胱氨酸残基的巯基， CANPS的作用 CANPS的作用 • 通过分裂特定的肌原纤维蛋白质影响肉的嫩化 • 同溶菌体蛋白酶协同作用 • 死后僵直的肌肉缓慢松弛，这样产生的肉具有良好的质构 死后僵直的肌肉缓慢松弛，
固定化酶
1.2 脂肪酶的研究与应用1.2.1 脂肪酶的研究概况脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。
脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。
一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。
对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。
通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。
作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。
与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。
1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。
脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。
1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。
脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。
脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。
30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。
M., Tushar Ranjan (2020)指出天然油中高浓度的omega - 3脂肪酸(ɷ-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。
2011酶工程 第六章 固定化酶与固定化细胞
(2)固定化使酶和细胞的使用率提高
江南大学的孙志浩通过卡拉胶 包埋的方法，使酶的重复利用 30个批次后活性没有明显减少， 大大促进了酶的利用率，加速 了工艺工业化进程．
(3)可精简产物分离工序
底物和产物更容 易和酶分离
固定化酶也存在一些缺点
酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化 的成本，使工厂开始投资大。
(2) 共价结合法
借助共价键将酶的活性非必须侧 链基团或细胞表面基团（如氨基、 羧基、羟基、巯基、咪唑基等） 和载体的功能基团进行偶联以达 到固定化目的方法。 此法得到的固定化酶结合牢固、 稳定性好、利于连续使用，因此 它是目前应用最多的一类固定化 酶的方法。
共价偶联法的优点、缺点
共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、 稳定性好、利于连续使用。 共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应 条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活 力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间 构象，从而对酶的催化活性产生影响。
B 叠氮法
用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶， 步骤如下： 酯化 肼解 叠氮化 偶联
与酶中的氨基、羟基、巯基反应。
此反应适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CM—纤维素、
葡聚糖、聚氨基酸、乙烯 — 顺丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲 基纤维素为例，可先在酸等作用下转变为叠氮衍生物，这种 产物能在低温、pH 7.5—8.5 的情况下和酶的氨基直接偶联。 但叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。
E ．溴化氰法
与酶中的氨基反应
F 异硫氰酸法
含芳香氨基的载体也可先用硫光气处理成异硫氰酸 (或异氰
酸)盐的衍生物，这样得到的产物极易在温和条件下和酶分
子的氨基反应。由于在中性pH条件下优先和α-氨基反应， 因此可进行选择性偶联。 （见示意图）
第六章固定化酶
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
50
迄今已有许多酶用离子结合法固定化， 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基 酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。
51
DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH 和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液( 水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g 湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸 去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗 涤固定化酶，置4℃备用。
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
第六章固定化酶?第一节概述?第二节固定化酶的制备?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第四节固定化细胞?第五节固定化辅酶和原生质体?第六节固定化酶细胞的应用生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇间歇吸附包埋交联化学连续材料材料膜固定膜固定酶液固定化再循环系统再循环系统连续连续间歇间歇间歇间歇第一节概述固定化酶的发展史凝胶吸附化学连接物凝胶吸附半连续分批连续活塞模式搅拌连续反应器连续活塞模式搅拌连续反应器图61生物催化剂作用方式示意游离酶在使用过程中不足之处
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
50
迄今已有许多酶用离子结合法固定化， 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基 酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。
51
DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH 和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液( 水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g 湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸 去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗 涤固定化酶，置4℃备用。
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
第六章固定化酶?第一节概述?第二节固定化酶的制备?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第四节固定化细胞?第五节固定化辅酶和原生质体?第六节固定化酶细胞的应用生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇间歇吸附包埋交联化学连续材料材料膜固定膜固定酶液固定化再循环系统再循环系统连续连续间歇间歇间歇间歇第一节概述固定化酶的发展史凝胶吸附化学连接物凝胶吸附半连续分批连续活塞模式搅拌连续反应器连续活塞模式搅拌连续反应器图61生物催化剂作用方式示意游离酶在使用过程中不足之处
郭勇酶工程(第三版)第六章固定化酶
Chapter 6
Immobilized Enzyme
第六章 固定化酶和固定化细 胞、原生质体
制作：郑穗平
酶催化的优点 ——作为一种生物催化剂，酶参与生物 体内的各种代谢反应，具有专一性强、 催化效率高及作用条件温和等优点。
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配臵一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 （N,N‘-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰
胺，N,N’-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温
与一定量的酶液等混合 均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二 胺，混合后让其静臵聚合即可获得。 优点：机械强度高，可调节凝胶孔径 缺点：丙烯酰胺单体有毒性
将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水 中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50°C， 与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到 预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植 物油中，成型后再臵于氯化钾溶液中的到 球状固定化颗粒。 优点：通透性能好，对细胞无毒害。
（4）明胶包埋法 将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中， 加热溶解。灭菌后冷却到35°C以上，与一 定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的 胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能 试剂交联。
Immobilized Enzyme
第六章 固定化酶和固定化细 胞、原生质体
制作：郑穗平
酶催化的优点 ——作为一种生物催化剂，酶参与生物 体内的各种代谢反应，具有专一性强、 催化效率高及作用条件温和等优点。
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配臵一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 （N,N‘-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰
胺，N,N’-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温
与一定量的酶液等混合 均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二 胺，混合后让其静臵聚合即可获得。 优点：机械强度高，可调节凝胶孔径 缺点：丙烯酰胺单体有毒性
将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水 中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50°C， 与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到 预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植 物油中，成型后再臵于氯化钾溶液中的到 球状固定化颗粒。 优点：通透性能好，对细胞无毒害。
（4）明胶包埋法 将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中， 加热溶解。灭菌后冷却到35°C以上，与一 定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的 胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能 试剂交联。
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酶的pH值低； 催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH值一般不
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
3）载体不带电荷，最适Ph一般不改变（有时也会有所 改变，但不是由于载体的带电性质所引起的。）
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。
3．固定化酶pH的变化
（2）产物性质对pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离
酶的pH值高； 催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH值比游离
5—15
℃
同一种酶，用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其
最适温度也有可能提℃高。 Eg：氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法
固定化后，其最适温度（72）比游离酶的最适温度（60） 提高12度；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度（67） 比游离酶提高7度；而用烷基化法固定化的氨基酰化酶， 其最适温度却比游离酶有所降低。
6
固定化酶正式定名
在1971年第一届国际酶工程会议上，正 式建议采用“固定化酶”（immobilized enzyme）的名称。
7
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:
（l）极易将固定化酶与底物、产物分开； （2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱
连续反应； （3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； （4）酶反应过程能够加以严格控制； （5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； （6）较游离酶更适合于多酶反应； （7）可以增加产物的收率，提高产物的质量； （8）酶的使用效率提高，成本降低。
8
缺 点：
（l）固定化时，酶活力有损失； （2）增加了生产的成本，工厂初始投资大； （3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子
底物，对大分子不适宜； （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应； （5）胞内酶必须经过酶的分离程序。
9
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一． 影响固定化酶性质的因素 二． 固定化后酶性质的变化 三． 评价固定化酶的指标
第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）
的应用
酶催化的缺陷
（1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难
设想
——如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊 的相，使它与整体相（或整体流体）分 隔开，但仍能进行底物和效应物（激活 剂或抑制剂）的分子交换。
二． 固定化酶的性质
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降
20世纪从60年代起，固定化酶的研究在工业生产规模应 用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸， 实现了酶应用史上的一大变革。
4
固定化酶的定义
所谓固定化酶，是指在一定空间内呈 闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应， 反应后的酶可以回收重复使用。
5
“水不溶酶”（water insoluble enzyme） “固相酶”（solid phase enzyme）
3． pH的变化
PH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后
不能生成产物。
固定化酶pH的变化
1） 载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向 碱性方向移动）。
2）载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向 酸性方向移动）。
以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖
核酸为底物时，催化速率仅为游离酶的2%，而以环化鸟苷酸为底物 时，催化速率可达游离酶的50—60%。
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
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进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
3）载体不带电荷，最适Ph一般不改变（有时也会有所 改变，但不是由于载体的带电性质所引起的。）
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。
3．固定化酶pH的变化
（2）产物性质对pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离
酶的pH值高； 催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH值比游离
5—15
℃
同一种酶，用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其
最适温度也有可能提℃高。 Eg：氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法
固定化后，其最适温度（72）比游离酶的最适温度（60） 提高12度；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度（67） 比游离酶提高7度；而用烷基化法固定化的氨基酰化酶， 其最适温度却比游离酶有所降低。
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固定化酶正式定名
在1971年第一届国际酶工程会议上，正 式建议采用“固定化酶”（immobilized enzyme）的名称。
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固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:
（l）极易将固定化酶与底物、产物分开； （2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱
连续反应； （3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； （4）酶反应过程能够加以严格控制； （5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； （6）较游离酶更适合于多酶反应； （7）可以增加产物的收率，提高产物的质量； （8）酶的使用效率提高，成本降低。
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缺 点：
（l）固定化时，酶活力有损失； （2）增加了生产的成本，工厂初始投资大； （3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子
底物，对大分子不适宜； （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应； （5）胞内酶必须经过酶的分离程序。
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第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一． 影响固定化酶性质的因素 二． 固定化后酶性质的变化 三． 评价固定化酶的指标
第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）
的应用
酶催化的缺陷
（1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难
设想
——如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊 的相，使它与整体相（或整体流体）分 隔开，但仍能进行底物和效应物（激活 剂或抑制剂）的分子交换。
二． 固定化酶的性质
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降
20世纪从60年代起，固定化酶的研究在工业生产规模应 用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸， 实现了酶应用史上的一大变革。
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固定化酶的定义
所谓固定化酶，是指在一定空间内呈 闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应， 反应后的酶可以回收重复使用。
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“水不溶酶”（water insoluble enzyme） “固相酶”（solid phase enzyme）
3． pH的变化
PH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后
不能生成产物。
固定化酶pH的变化
1） 载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向 碱性方向移动）。
2）载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向 酸性方向移动）。
以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖
核酸为底物时，催化速率仅为游离酶的2%，而以环化鸟苷酸为底物 时，催化速率可达游离酶的50—60%。