如何选择合适的细胞稳转株
稳定细胞株构建方法
稳定细胞株构建方法我折腾了好久稳定细胞株构建方法，总算找到点门道。
说实话，稳定细胞株构建这事，我一开始也是瞎摸索。
我先讲讲我最开始犯的错啊。
我就想着只要把目的基因转染进细胞不就成了嘛。
我就用了脂质体转染法，转染的时候，我就按照说明书大概弄了一下那个比例，结果转染效率超级低。
就像你想给一群人送信，结果只找到几个人能帮忙送，大部分信都送不出去一样，失败得很彻底。
后来我就研究转染效率低的原因。
发现那个脂质体和DNA的比例很关键。
我就开始一点一点试着调整比例，每次调整完就做一次转染，看看效果。
这就像做饭，盐放多放少得试出个合适的量。
经过好多次尝试，转染效率终于提高了一些。
转染成功只是第一步。
接下来要用抗生素筛选。
我一开始用的抗生素浓度不太对。
浓度低了吧，好多没转染成功的细胞也能存活，这样建出的细胞株就不纯。
浓度高了呢，连转染成功的细胞都被杀死了。
这就是我又一个失败的经历。
然后我就查各种资料，询问身边的同行，大概确定了不同细胞类型适合的抗生素浓度范围，再在这个范围内进行多次测试，才找到了合适的浓度。
我还试过病毒感染的方法构建稳定细胞株。
这个方法呢，病毒包装就很关键。
我自己包病毒的时候，一不小心就容易污染，前面的努力就白费了。
就像盖房子，基础都被破坏掉了。
我总结的经验就是，在包病毒的时候，所有的操作都要超级小心，从试剂的准备开始，每一步都要保证是无菌的，手消毒，台面消毒，试剂瓶消毒一个都不能少。
还有一点，无论是哪种转染或者感染的方法，细胞状态很重要。
我有一次没注意细胞的状态，拿了状态不太好的细胞做实验，转染后细胞死了一大片。
所以呢，养成提前查看细胞状态的习惯特别好。
一定要找那些看起来很健康的细胞来进行构建操作。
总的来说，稳定细胞株构建真的是个需要耐心，不断尝试并且细心对待每一个环节的工作啊。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选的流程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：首先，需要构建表达目的基因的质粒载体。
该载体通常含有启动子、目的基因和选择标记基因等元件。
启动子可以控制基因的转录水平，目的基因可以是感兴趣的基因或报告基因，选择标记基因则用于筛选稳定细胞株。
2.细胞转染：将构建好的表达载体导入目标细胞中。
转染可以采用多种方法，如化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
转染后，目标细胞中的外源基因片段将被导入细胞质。
3.选择压力：为了筛选稳定细胞株，需要加入选择压力。
选择压力可以是抗生素、毒素或药物等，只有在压力下能够存活的细胞才能继续生长和繁殖。
4.单克隆细胞筛选：经过选择压力后，细胞群体中可能存在不同的细胞克隆。
为了获得单克隆稳定细胞株，需要进行单克隆细胞筛选。
常用的方法有稀释分选法、限稀稀释法和流式细胞术等。
5.鉴定稳定细胞株：筛选出的单克隆细胞株需要进行进一步的鉴定。
可以通过PCR、Western blot、荧光显微镜观察等方法验证目的基因的稳定表达。
总结起来，稳定细胞株筛选的流程包括构建表达载体、细胞转染、选择压力、单克隆细胞筛选和鉴定稳定细胞株等步骤。
这个流程能够筛选出稳定地表达目的基因的细胞株，为基因功能研究和药物开发提供可靠的实验模型。
在实际操作中，稳定细胞株筛选的流程可能会因实验目的和细胞类型的不同而有所调整。
但总体而言，以上步骤是筛选稳定细胞株的基本流程。
通过稳定细胞株的筛选，可以获得稳定表达目的基因的细胞株，从而开展进一步的实验和研究。
稳定细胞株的筛选是基因功能研究和药物开发中必不可少的一步。
通过稳定细胞株的筛选，可以实现对目的基因的稳定表达，为研究基因功能和开发新药物提供有力支持。
因此，掌握稳定细胞株筛选的流程和方法对于科研人员和药物开发人员具有重要意义。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞工程和生物医学研究中非常重要的一环。
以下是关于稳定细胞系筛选的50条注意事项，并对每一条进行详细描述：1. 选择合适的细胞系来源：在进行稳转细胞系筛选前，首先要选择合适的细胞系来源，以确保细胞系的稳定性和易转染性。
常用的细胞系来源包括HEK293、CHO、MDCK等。
2. 确定转染条件：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定适合的转染条件，包括转染试剂种类、浓度、转染时间和细胞密度等。
3. 标定荧光素酶检测试剂盒：在进行稳转细胞系筛选时，需要使用荧光素酶检测试剂盒来检测稳定转染细胞系的活性。
4. 建立适当的质粒载体：选择适当的质粒载体对稳转细胞系的构建和筛选至关重要。
常用的载体包括pCDNA3.1、pcDNA3.1+、pEGFP-N1等。
5. 筛选适宜的筛选标记物：在进行稳转细胞系筛选前，需要选择适宜的筛选标记物，如抗生素、蛋白荧光标记等。
6. 确定稳定转染细胞系的稳定性：在进行稳定转染细胞系筛选时，需要对转染细胞系的稳定性进行验证，通常采用长期培养和连续传代的方式来确保转染细胞系的稳定性。
7. 选择适合的培养基和培养条件：在进行稳转细胞系筛选时，需要选择适合的培养基和培养条件以促进细胞系的稳定生长和表达。
8. 确定荧光素酶基因的稳定插入：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保荧光素酶基因在细胞基因组中的稳定插入，通常采用PCR、Southern blotting等方法来验证。
9. 考虑基因组的稳定性：在进行稳转细胞系筛选前，需要考虑基因组的稳定性，并尽量避免对细胞基因组的不良影响。
10. 确定筛选标准：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定筛选标准，如荧光素酶基因活性的阈值、抗生素的最佳浓度等。
11. 使用酶切鉴定：使用酶切鉴定来确保质粒载体的正确构建和稳定转染细胞系的正确筛选。
12. 建立稳定转染细胞系的储备：在进行稳转细胞系筛选后，需要建立稳定转染细胞系的储备，以备后续实验使用。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞株精要总结G418筛选稳定表达细胞系总结⼀分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染⾄宿主细胞染⾊体。
外源基因进⼊细胞后，部分能够通过细胞质进⼊细胞核内，根据细胞类型，⾄多80％的进⼊核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进⼊细胞的外源DNA通过系列⾮同源性分⼦间重组核连接，形成巨⼤的***结构最终整合进细胞染⾊体。
细胞基因组⾃由部分表达，所以整合并不⼀定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，⽽且整合到不同的染⾊体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是⼩概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
⼀般情况下这种新表型由共转染的编码抗⽣素抗性基因提供。
细菌Tn5转座⼦序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成⽆毒形式。
G418是⼀种氨基糖类抗⽣素，其结构与新霉素、庆⼤霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能⽽阻断蛋⽩质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原⽣动物和蠕⾍。
是稳定转染最常⽤的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地⽅后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从⽽获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的⾼效表达 ,使细胞获得抗性⽽能在含有Ｇ418的选择性培养基中⽣长。
Ｇ418的这⼀选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等⽅⾯得以⼴泛应⽤。
在进⾏转染时细胞膜受到影响，抗⽣素可能对细胞产⽣较⼤影响，加上G418有杀菌作⽤，所以有⼈主张转让时不加其它抗⽣素。
其实G418本⾝有很好的杀菌效果，在⽤G418进⾏筛选的过程中很少会发⽣污染。
但有⼀点，其实我觉得问题也不是很⼤，那就是：在⽼外的⼀本实验⼿册中提到，在脂质体转染时所⽤培养基中最好不加任何抗⽣素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗⽣素对细胞损伤较⼤。
因为庆⼤霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作⽤完全⼀样。
如何构建稳定转染的细胞系（株）？
如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。
为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。
细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。
转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。
Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。
选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。
过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。
在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。
单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。
为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。
三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。
根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。
构建细胞稳转株
构建细胞稳转株（一）慢病毒包装：1．转染前24小时，将293T细胞以4-5×106接种于10cm的大皿中，加入10ml DMEM 完全培养基，轻轻摇晃，混匀，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
注：细胞转染前密度应达到80%-90%。
3．充分混匀，离心管1，离心管2室温孵育5分钟。
4．将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
5．室温孵育转染混合液15分钟6．将步骤1准备的细胞换液（95%DMEM+5%灭活FBS）。
7．将1ml转染混合液逐滴加入换液好的细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀。
8．37℃培养。
4-6小时后，用10ml培养基换液（90%DMEM+5%灭活FBS+5%双抗）。
9．转染48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
（二）慢病毒感染待测细胞：1.取新包装的或冻存于-80℃冰箱的慢病毒于冰上缓慢解冻。
2.慢病毒与培养基（DMEM+5%灭活FBS+1%双抗）按一定的体积混匀，加转染增强剂polybrene至终浓度为10μg/ml。
3.待转染的细胞吸去原培养液，PBS洗3次。
4.把混合好的慢病毒培养基加到细胞培养瓶中进行感染。
5.将细胞培养瓶放回培养箱中培养过夜，PBS洗3次，更换为完全培养基继续培养。
6.感染72h后，荧光显微镜观察荧光，拍照，分析细胞生长状态。
（三）稳转细胞株筛选：将慢病毒感染成功的细胞继续培养，并在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。
筛选持续一周，在荧光显微镜下观察，至感染效率达到80%嘌呤霉素最佳筛选浓度测定：将对数生长期的细胞消化，均匀铺在24孔板上，5×104/孔。
隔夜将细胞换液，并设置嘌呤霉素梯度：0 ug/ml；0.5 ug/ml；1.0 ug/ml；1.5 ug/ml；2.0 ug/ml；2.5 ug/ml48 h后换正常培养基。
稳定细胞名词解释
稳定细胞名词解释
稳定细胞（stable cells)又称静止细胞（quiescent cell)。
在生理情况下，这类细胞增殖细胞不明显，在细胞增殖周期中处于静止（G0），但受到组织损伤的刺激时，则进入DNA合成前期（G1），表现出较强的再生能力。
稳定细胞株筛选方法
1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系：
对大多数细胞转染效率较低。
对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。
但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。
另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。
2、病毒感染筛选稳定细胞株：
病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。
转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
转染细胞的稳定筛选1、药物筛选前的准备药筛前应确定药物筛选浓度,不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。
药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可.2、药物筛选注意事项（1）药筛的时间加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h空白对照加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药,待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完,但还需继续加药。
（2)换液如果加药后,细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡.另外，随着细胞的代谢,抗生素的活性会降低，因此,每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液.3、克隆筛选注意事项若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞,因此最好选择带有荧光较强的细胞。
若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑.不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。
因此，挑克隆时,应尽量多挑几个克隆，20个左右.4、稳定克隆筛选步骤（1）有限稀释法步骤a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可，若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来b)对消化后的细胞悬液进行计数(如果细胞数量过大,可先稀释后计数）c)计算后，用枪头吸取约200个细胞(其中有部分为死细胞)到10ml培养液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul,这样有的孔就可能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2—3个96孔板)e)待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉，只有一个细胞的孔划勾,以做好标记，如果只有一个细胞的孔数量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾,但这样克隆就可能不纯。
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如何选择合适的细胞稳转株
细胞稳转株是一种经过特定基因修饰的细胞株，可根据实验所需表达外源基因、进行基因敲除、敲入、以及精确改变基因序列（如点突变）。
对比一般瞬转方法，利用细胞稳转株开展实验能够获得长期而稳定的特定性状，因此有助于增强实验的可重复性。
细胞稳转株除了可用于基因调控研究，也非常适合于长周期的药物筛选和药理学研究、重组蛋白和抗体生产等实验。
载体家凭借其资源完备的载体定制平台，通过病毒转导常规肿瘤细胞的方式可构建多种应用类型的细胞稳转株。
过表达模型细胞稳转株
通过慢病毒系统或转座子系统将外源基因表达框稳定整合进靶细胞基因组，实现外源基因在靶细胞的长期稳定表达。
对比瞬转方法，构建过表达稳转株可避免瞬转中因转染效率导致的表达效率不一致的问题。
构建好的细胞株中的外源基因不会因为细胞传代而丢失，可以持续表达特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究，重复实验时不需要对细胞重新转染质粒，大为节省了实验时间。
诱导表达模型细胞稳转株
采用Tet-on系统进行诱导表达目的基因，虽然可以直接进行质粒瞬转，但是载体家亦提供该类载体的慢病毒包装以构建相关的稳转细胞株。
构建好的Tet-On系统细胞株同时表达tTS和rtTA 两种转录调控因子,而目的基因的表达可受四环素调控。
其中tTS在四环素不存在的情况下会结合目的基因的上游TRE启动子，抑制目的基因表达。
在细胞体系中添加四环素或其类似物后，rtTA进行响应并结合TRE启动子，激活目的基因表达。
shRNA干扰模型细胞稳转株
shRNA稳转株一般使用慢病毒或逆转录病毒在靶细胞基因组中导入shRNA表达框，实现shRNA在细胞系中的长期稳定表达。
不同于siRNA瞬转，shRNA稳转株可内源性地稳定表达siRNA效果，不受转染效率影响，从而获得更稳定的基因敲低效果
CRISPR基因编辑细胞稳转株
构建CRISPR基因编辑细胞稳转株是当今研究基因和细胞功能关系的流行工具。
通过gRNA引导Cas9靶向靶细胞基因组特定序列的CRISPR基因编辑，如基因敲除、敲入和定点突变，可以从DNA水平修饰靶细胞的基因序列。
载体家提供两种gRNA表达模式，第一种是转导gRNA/Cas9共表达载体，gRNA和Cas9在细胞株中同时表达。
第二种是构建Cas9表达稳转株，再根据实验需求导入gRNA表达载体。
使用单Cas9表达稳转株可以获得更大的实验灵活性，如导入多个gRNA打靶GOI，或者多个gRNA与多种Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之间进行搭配等。
CRISPR基因编辑系统可选择单gRNA或双gRNA表达方式。
双gRNA表达载体常用于以下需要两个gRNA同时打靶的场景：1）双gRNA引导两个Cas9 nickase分别打靶靶位点的正反义DNA链，形成DSB并获得比单gRNA更特异的打靶效果；2）通过在形成两个DSB，实现目标序列的大片段删除；3）同时打靶两个不同的基因。
双gRNA表达载体由两个U6启动子驱动gRNA的表达。
载体家CRISPR基因编辑载体可采用多类方式进行转导靶细胞。
除基因敲入和定点突变常用的gRNA瞬转Cas9稳转株的方法外，我们还提供慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、PiggyBac转座子载体等多种外源基因转导方式，以满足体外或体内多样CRISPR基因编辑实验需求。
CRISPR基因调控细胞稳转株
该种细胞株采用的CRISPRa和CRISPRi技术是新兴的两种基因表达调控工具。
CRISPRa采用的dCas9-SAM基因激活系统由个三个组分构成，每个组分分别由单独的慢病毒载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。
表达这三种组分的细胞株中，用户定制的gRNA募集MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64到gRNA靶位点，从而组装出SAM 转录激活复合体。
SAM复合体一般结合于靶基因上游启动子区域，通过VP64，p65和HSF1激活结构域之间的协同相互作用实现下游靶基因的转录激活。
该种细胞株可以用于基因组的大规模筛选，如文库构建过程，也可用于研究单个或一系列基因的表达功能。
CRISPRi采用dCas-KRAB系统，可实现比RNAi更高效的基因沉默效果，但是对比采用CRISPR 敲除构建的功能缺失模型，又有不改变靶基因序列的优点。
dCas9-KRAB CRISPRi细胞株使用慢病毒转导gRNA表达载体和dCas9-KRAB（或者dCas9-KRAB-MeCP2）表达载体。
细胞株表达的dCas9-KRAB转录抑制复合物结合于靶基因上游区域，阻碍RNA pol进行下游转录，可从源头上抑制基因功能性表达。
冠状病毒试验用细胞株
载体家提供的CoronaAssay™冠状病毒试验用细胞株是我们专门为研究冠状病毒入侵细胞机制开发的定制产品，由Hela细胞和293T细胞改造获得。
该细胞株可稳定表达一系列已知的野生型或突变型冠状病毒S蛋白受体，如人源ACE2、DDP4和ANPEP，以及小鼠Cwacam1。
CoronaAssay™细胞株也可以表达人源TMPRSS2，一种跨膜丝氨酸蛋白酶，对利用ACE2、DPP4、ANPEP或其他唾液酸受体的冠状病毒感染过程有协同作用。
对比寻找表达S蛋白受体的天然细胞，人工表达S蛋白的细胞株显然具有更强的灵活性以及可实现更高的S蛋白受体表达水平。
载体家的细胞技术团队拥有资深经验，除了以上类型的稳转株构建，还可以进行量身定做的个性化基因修饰的细胞株。
根据实验目的、修饰位点和细胞株类型选择最佳的外源基因导入
方式。
标准药筛过后，多克隆细胞群或者单克隆细胞系经传代、验证后才进行交付。
所有使用细胞株均保证携带理想的基因型，无污染且经ATCC标准认证。
云舟生物科技（广州）有限公司网址：。