双水相萃取
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
12 双水相萃取
（二）pH值会影响磷酸 盐的解的比例，而影响分配 系数。 pH的微小变化会使蛋白 质的分配系数改变2～3 个数量级。
0.8 0.6 0.4 0.2 0 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
K
pH
温度影响相图，特别在临界点附近，因而 也影响分配系数， 温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越 高。
双水相萃取
双水相系统：因两种水溶性聚合物的水溶液，或 一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相 容性而形成有明显界面的两相系统
特点：两相均含有大量的水（高达80%以上）； 通用性强，大分子、小分子都可萃取； 萃取环境和条件温和，稳定性好； 步骤简单，可连续操作，易于放大 ； 细胞碎片不需去除。
缺点和不足
双水相系统
• 是指某些高聚物之间或高聚物 与无机盐之间在水中以适当的 浓度溶解会形成互不相溶的两 水相或多水相系统
（一）两水相的形成
原理
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 不同而达到分离纯化生物大分子的目的。 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在 斥力，在达到平衡后，分成两相，两种聚 合物分别进入到一相中。
• 若提取的酶在于富含葡聚糖的下相中，也可以采 用超滤方法，因在PEG/Dex双水相系统中使用 的葡聚糖分子量高于4万，超滤可将小于3万分子 量的酶分离。
（三）无机盐的循环
• 一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6℃， 使盐结晶析出，然后用离心机分离收集； • 另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收 盐类。
双水相萃取技术的进展
廉价双水相体系的开发：
两种双水相体系的比较
体 系 优 点 缺 点
高聚物/高聚物
盐浓度低，活性损 失小，可用离子交 换层析纯化 成本低，粘度小， 比较适合工业规模 的应用
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取全解
聚乙二醇
非离子型聚合物/ 非离子型聚 合物
聚丙二醇
聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
聚合物/ 低分子量化合物
葡聚糖硫酸钠
葡聚糖
羧甲基纤维素钠
丙醇
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相的形成
在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时， 会出现两个不相混溶的水相
②聚合物∕无机盐双水相
某些聚合物溶液和一些无机盐溶液 相混时，在一定浓度下，由于盐析作 用，也会形成两相，即聚合物/ 无机 盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸 盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外， 能形成双水相体系的物质还有高分子 电解质、低分子量化合物。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物 葡聚糖
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
缺点：
• 成相聚合物的成本较高， 且高聚物回收困难。 • 水溶性高聚物大多数粘度 较大，不易定量控制。 • 易乳化，相分离时间较长。 • 影响因素复杂。
3、双水相萃取原理
(1) 分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的 原理相似, 都是依据物质在两相间的选择 性分配。当萃取体系的性质不同, 物质进 入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、 疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之 间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的 浓度不同, 从而达到分离的目的。
第五章 双水相萃取
• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
5.Βιβλιοθήκη 6.第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
双水相萃取
各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐
双水相萃取技术
新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零，此时分配系数为1，即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系统远离临界点，系线 长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增 大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1)，即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数，如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这 一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中，下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素（盐的水合作用、配体相互作用）在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式： lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数；T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大，λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质，可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。
双水相萃取
双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作 用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对 分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异 种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚 合物的不相溶性。
操作步骤
一、重点 双水相萃取放大容易：一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模。具体实验步骤： 1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。 2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。离心管封口后充分混合。 3、1800－2000g下离心3－5min，使两相完全分离。 4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。 5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活 性测定中产生的系统误差。 6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。 二、特点： 1、含水量高（70%～90%），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。 2、不存在有机溶剂残留问题。3、易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。
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实训1 双水相萃取相图的制作
一、实训目的
1. 学习双水相分离萃取的原理和方法
2. 学习双水相萃取相图的制作 二、实训原理
双水相萃取法是利用物质在互不相容的两个水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
两水相的形成：高聚物与无机盐在水中由于盐析的作用会形成两个相，如PEG 与硫酸盐或碱性磷酸盐。
两种亲水性高聚物在水中由于聚合物的不相容性也会形成两个相。
但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相，双水相形成的定量关系可用相图来表示。
相图是一根双节线, 把均匀区和两相区分隔开来。
当成相组分的配比取在：线的下方时，为均相区； 曲线的上方时，为两相区；在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。
相图中TMB 称为系线；T 代表上相组成；B 代表下相组成；同一条系线上各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同。
V T / V B = BM / MT
三、实训器材、试剂、材料
1.器材：试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管。
2.试剂：聚乙二醇2000（PEG2000），硫酸铵。
四、实训操作步骤
1.PEG2000（NH 4)2SO 4双水相体系相图的测定
（1）取10%（g/ mL ）PEG2000溶液10mL 于三角瓶中。
（2）用40%（g/mL ）（NH 4)2SO 4溶液装入滴定管中滴定至三角并中溶液出现浑浊，记录）NH4)2SO 4溶液消耗的体积。
加入1mL 水使溶液澄清，继续用（NH 4)2SO 4溶液滴定至浑浊，重复7～8次，记录每次（NH 4)2SO 4溶液消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG2000和（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）。
（3） 以（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）为横坐标，PEG2000的浓度（g/mL ）为纵坐标，绘制PEG2000- （NH 4)2SO 4双水相体系相图。
2. 相图制作表
10%PEG2000 10mL 温度T=20℃
PEG2000 %
(NH 4)2SO 4 %
两相 均相
五、结果与讨论
1.如何正确绘制相图。
2.如何根据相图配制双水相体系。
实训2 两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一、实训目的
1.学习双水相分离萃取蛋白质的原理和方法。
2.掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作。
3.学习掌握双水相萃取分配系数的测定。
二、实训原理
1. 在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。
2. 分配系数：当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度之比称为分配系数，
分配系数K = C上/ C下;
3.相比：上下相体积比称为相比R = V上/ V下
4.以牛奶中的酪蛋白为实验对象，在PEG/(NH4)2SO4两水相系统进行分配。
5.用考马斯亮兰(CBB G-250)比色法分别测定上下相中总蛋白的含量。
CBB G-250是一种染
料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大吸收值。
低浓度（0.01～1.0mg/mL）时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
三、试剂、材料
1. 考马斯亮兰G-250溶液配制
精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml 95%乙醇中，并加入50ml 85% 浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml。
2. 标准蛋白溶液-牛血清蛋白溶液配制
精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成120 g/ml的牛血清蛋白原液。
四、操作步聚
PEG4000 10g 加入20ml 水，配制50%的PEG4000溶液，加入10ml 牛奶，再加入4.5g 硫酸铵，搅拌，溶解，3000rpm 离心20min ，分别记录上下相体积、取样，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
3. 两相中总蛋白的测定：
上相液：吸取0.5ml ，蒸馏水定容至50ml ，按下表操作。
下相液：上相完全吸掉，并吸掉部分下相，再取样。
五、结果计算 1.标准曲线 OD = K · X （μg ）＋ b 求斜率K 和截距b
2. 分配系数 K = C 上 / C 下
ml g K
b OD C /100μ⨯-=上
上相ml g K b OD C /1.01μ⨯-=下下相
双水相萃取案例 案例1 双水相萃取血红蛋白
血红蛋白（hemoglobin,HB ）是由四条多肽链组成——二条α链和二条β链，每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe 2+不被氧化。
分子质量为64458D ，等电点约为6.9。
双水相萃取血红蛋白的基本流程：
人或动物血液中预先加入3g/L 柠檬酸钠，防止血液凝固。
离心后，用生理盐水洗涤三次。
血红蛋白的分配系数随pH 的升高而升高，随PEG 分子量的增加而下降。
在PEG1500 12.5%，pH10，血红蛋白的分配系数最高，为2.96。
前萃取条件：系线长度22%，PEG1500 18.9%，磷酸钾盐9%，相平衡时间5～10min ，离心分相5000g ，5～10min ，得上相体积521mL ，下相体积330 mL 。
细胞碎片和各种细胞质在下相富集，并形成界面沉淀。
上相澄清透明，下相浑浊且不透明。
下相弃去后，单独存放，有胶凝化现象。
血红蛋白部分形成界面沉淀，造成损失。
前萃取收率64.9%。
反萃取条件：系线长度22%，，PEG1500 15.5%，磷酸钾盐与钠盐11%，相平衡时间5～10min ，离心分相5000g ，5～10min ，得上相体积370mL ，下相体积195 mL 。
上相与下相澄清透明。
上相弃去，血红蛋白在下相富集。
反萃取收率96.9%。
人或动物血液
（血浆） （红血球） 弃去 生理盐水洗涤 ） 下相（弃去） 下相 透析 纯品
案例2 双水相萃取基因重组人胰岛素生长因子-I（IGF-I）
基因重组人胰岛素生长因子-I（IGF-I）是一种生长激素，由肝分泌并入血液循环的中性多肽。
IGF-I能促进细胞增殖，分化和细胞分泌作用。
IGF-I能对所有胰岛素靶器官起经典的胰岛素效应，能促进脂肪组织的糖代谢和糖转运，促进脂肪和糖元合成。
IGF-I能增进鸟氨酸脱羧酶的活性，促进DNA、RNA和蛋白质合成，最终导致细胞增殖。
IGF-I对动物的生长发育和繁殖都有促进的作用。
IGF-I的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性。
一条肽链，非糖基化蛋白，由70个氨基酸残基构成，分子质量为7.6KD，等电点为7.6。
工业上由大肠杆菌表达生产IGF-I。
发酵后的提取与复性过程基本如下：
（1）包含体溶解将1200L发酵液（含有IGF-I 3.8g/L）泵入反应罐中，加入220L含174kg 尿素的水溶液，接着加入8L50%氢氧化钠溶液，调pH=10.0。
再加入2.9kg二硫苏糖醇（DTT），3L50%氢氧化钠溶液，复调pH=10.0。
反应罐内充氮气，37℃反应60min，随后冷却到22℃，进入双水相萃取工段。
（2）双水相萃取仍充氮气保护，萃取温度22℃。
向上一步获得的液体中加入250kgPEG8000和90kg硫酸钠，搅拌40min。
取样离心分析表明，此时IGF-I分配系数为8.5，上下相的体积比为2.6。
两相混合后用Westfalia SB-7分离机分相，得1300L上相、550L下相，下相弃去。
不同条件下IGF-I的分配系数、相比和萃取上相收率见表。
反相高效液相色谱分析表明，IGF-I萃取上相收率为88%，上相继续充怕氮气保护。
（3）IGF-I沉淀向前步获得的1300L上相中加入36L 2mol/L磷酸，调pH=7.0。
22℃下轻微搅拌8h，反相高效色谱分析表明，此时有96% IGF-I沉淀。
沉淀用Westfalia SB-7分离机富集，得沉淀88kg。
（4）复性取部分沉淀17.6kg用65L以下溶液溶解：含2mol/L尿素，10mmol/L二硫苏糖醇，10%氢氧化钠溶液，调pH=10.0。
然后加入到700L复性缓冲液（含2mol/L尿素，1mol/L氯化钠溶液，19%（体积分数）乙醇，20mmol/L甘氨酸，0.5µmol/L铜离子，pH=10.5）中，复性在22℃下进行，轻微搅拌，通入氧气280mL/min。
3h后，复性结束，停止通氧，用磷酸调pH=3.5。
反相高效液相色谱表明，复性收率为50%。