蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和功能调控
蛋白质的修饰和功能调控蛋白质是生命体中最基本的分子组成部分之一，它们参与了细胞的几乎所有生物学过程。
然而，蛋白质单独的氨基酸序列并不能完全解释它们的多样功能。
蛋白质的修饰和功能调控起着非常重要的作用，通过化学修饰以及与其他分子的相互作用，蛋白质的功能可以被调节和扩展。
一、蛋白质修饰的类型及功能1. 磷酸化修饰磷酸化修饰是一种常见的蛋白质修饰方式，通过将磷酸基团共价地添加到蛋白质的特定氨基酸上，如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
这种修饰方式可以影响蛋白质的空间结构和电荷状态，从而改变其功能。
例如，磷酸化可以调节酶的活性，参与信号转导通路，调控细胞增殖和凋亡等过程。
2. 甲基化修饰甲基化修饰是一种将甲基基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的亲水性、电荷状态以及相互作用的能力，从而调节蛋白质的功能。
例如，甲基化修饰可以在染色质结构的调控中起到重要作用，调节基因的转录和表达。
3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是一种将乙酰基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构和电荷状态，影响蛋白质的功能。
例如，乙酰化可以调节组蛋白的结构，影响染色质的结构和稳定性，从而调控基因的表达。
4. 糖基化修饰糖基化修饰是一种将糖基团共价地添加到蛋白质的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构、稳定性和溶解度，影响蛋白质的功能。
例如，糖基化修饰可以参与细胞黏附、信号转导和免疫应答等重要的生物学过程。
二、蛋白质修饰的调控机制1. 激酶和磷酸酶的作用蛋白质的磷酸化修饰通常是由激酶和磷酸酶调控的。
激酶可以添加磷酸基团到蛋白质上，而磷酸酶可以将磷酸基团去除。
这种激酶和磷酸酶之间的平衡调节，可以使蛋白质的磷酸化状态发生变化，从而影响其功能。
2. 转录调控因子的作用转录调控因子可以结合到蛋白质上，并改变蛋白质的修饰状态，从而调节蛋白质的功能。
通过与转录因子的相互作用，蛋白质可以参与基因的转录和表达调控。
蛋白质工程--3蛋白质的修饰和表达
2 蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定化主要是酶分子的固定
吸附法、交联法、包埋法、共价结合法 A）交联法 B）共价结合法 ➢载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度 和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团
➢反应必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中 进行
➢所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团的 副反应尽可能少
3. 羧基的化学修饰 通过碳二亚胺法、混合酸酐法与蛋白质分子上的氨基形成
酰胺键
二硫键的化学修饰
二硫键的还原：必须使用超剂量的巯基乙 醇，同时用过羧甲基化处理
判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二 硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还 原双向SDS-PAGE电泳技术
2 蛋白质的位点专一性修饰
专一性： 试剂对被修饰基团的专一性 对蛋白质分子中被修饰部位的专一性
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达
第一节 蛋白质的化学修饰
凡通过活性基团的引入或去除，而是蛋白质一级 结构发生改变的过程
影响因素： 1) 蛋白质功能基的反应活性 基团之间的氢键和静电作用 基团之间的空间阻力 2) 修饰剂的反应活性
1) 蛋白质修饰的交联方法和试剂
常用的方法通常有重氮化法、戊二醛法、过碘酸盐氧化 法、混合酸酐法及碳二亚胺法
A) 重氮化法: 重氮盐与蛋白质分子中的酪氨酸残基上的 邻位，即得到以偶氮键相连的结合物
B) 戊二醛法:戊二醛的两个醛基可以分别与两个相同或不 同分子上的伯氨基酸形成Schiff碱，将2分子以五碳链的 桥连接起来
1. 巯基的化学修饰
1）碘乙酸和碘乙酰胺 2）N-乙基马来酰亚胺：反应伴随光吸收的变化
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质是构成细胞的重要组成部分，它们在细胞内执行各种功能。
然而，在合成蛋白质的过程中仅仅翻译出氨基酸链还不足以确保完成蛋白质的结构和功能。
事实上，蛋白质在翻译后还需要经历修饰的过程，其中包括磷酸化、乙酰化和泛素化等多种修饰方式。
这些修饰过程不仅可以调节蛋白质的表达水平，还能调控其功能。
一、磷酸化修饰磷酸化是指通过酶类将磷酸基团添加到蛋白质的特定氨基酸上，通常是赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸。
磷酸化修饰在细胞信号传导、细胞周期调控和基因表达等生物过程中起着重要的作用。
磷酸化能够改变蛋白质的电荷分布，从而调节蛋白质的结构和功能。
例如，磷酸化可以导致蛋白质的构象变化，从而改变蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，磷酸化还可以介导蛋白质的定位和降解，以及参与细胞信号传导的级联反应等。
二、乙酰化修饰乙酰化是指在蛋白质上添加乙酰基团，通常是赖氨酸残基。
乙酰化修饰通过乙酰转移酶进行，在细胞代谢、细胞周期调控和染色质结构维持等生物过程中发挥着重要的作用。
乙酰化能够调节蛋白质的功能和稳定性。
通过乙酰化，蛋白质的电荷分布和空间结构发生改变，从而影响蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，乙酰化还能够调控蛋白质的定位和降解，参与细胞信号转导和基因表达的调控等重要生物过程。
三、泛素化修饰泛素化修饰是指在蛋白质上添加泛素分子，通常通过泛素连接酶（E3酶）介导完成。
泛素化修饰在细胞质调控、蛋白质降解和细胞凋亡等生物过程中发挥着重要的作用。
泛素化修饰能够标记蛋白质，使其被泛素酶体降解并确保细胞内的蛋白质质量控制。
此外，泛素化还可以调节蛋白质的定位和活性，影响其与其他分子的相互作用。
综上所述，蛋白质翻译后的修饰过程如磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质的表达水平和功能。
这些修饰对于细胞内各种生物过程的调控起着重要的作用。
蛋白质合成、修饰及分泌
03
蛋白质分泌
囊泡运
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02
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囊泡运输是指蛋白质在细胞内 合成后，通过一系列的囊泡转 运过程，将其从内质网等合成 场所转运至高尔基体进行加工 和修饰，再通过胞吐作用分泌 到细胞外。
囊泡运输是指蛋白质在细胞内 合成后，通过一系列的囊泡转 运过程，将其从内质网等合成 场所转运至高尔基体进行加工 和修饰，再通过胞吐作用分泌 到细胞外。
蛋白质合成、修饰及分泌
目
CONTENCT
录
• 蛋白质合成 • 蛋白质修饰 • 蛋白质分泌 • 蛋白质合成、修饰及分泌的相互关
系
01
蛋白质合成
氨基酸的合成
氨基酸是蛋白质的基本组成单 位，通过生物合成或从食物中 摄取来获得。
生物合成氨基酸主要通过转氨 基作用、脱羧基作用和氨基转 移作用等途径来完成。
不同的生物合成氨基酸的方式 不同，例如植物和微生物可以 通过光合作用将二氧化碳转化 为有机物，而动物则必须从食 物中摄取氨基酸。
核糖体合成
02
01
03
核糖体是细胞内合成蛋白质的场所，由大、小两个亚 基组成。
核糖体合成蛋白质的过程包括氨基酸的活化、肽链合 成的起始、肽链的延长和终止等步骤。
在核糖体合成过程中，mRNA作为模板指导氨基酸按 照特定的顺序排列，形成具有一定功能的蛋白质。
胞吐作用的异常可以导 致多种疾病的发生，如 神经退行性疾病、免疫 系统疾病等。
04
蛋白质合成、修饰及分泌的相互关系
合成与修饰的关系
合成是修饰的前提
蛋白质合成首先需要氨基酸按照特定 的序列连接成多肽链，然后经过翻译 后修饰，如磷酸化、乙酰化等，才能 形成具有生物活性的蛋白质。
翻译后修饰和蛋白质表达这篇文章将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响包括如何改变蛋白质功能
翻译后修饰和蛋白质表达这篇文章将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响包括如何改变蛋白质功能翻译后修饰和蛋白质表达蛋白质是生物体内最基本的分子之一，扮演着许多生命活动中重要角色。
蛋白质表达是指蛋白质合成和功能的产生过程，而翻译后修饰则在蛋白质合成后对其进行改变，进一步调节其功能和稳定性。
本文将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响，以及如何改变蛋白质功能。
一、翻译后修饰对蛋白质表达的影响1. 磷酸化修饰磷酸化是最常见的翻译后修饰方式之一，通过在蛋白质上添加磷酸基团来改变其结构和功能。
磷酸化修饰可以调节蛋白质的活性、稳定性以及与其他分子的相互作用。
磷酸化修饰还参与细胞信号传导、细胞周期调控等生物学过程。
2. 甲基化修饰甲基化修饰是通过在蛋白质上添加甲基基团来改变其功能。
甲基化修饰在染色质结构的调控中扮演重要角色，可以影响基因的转录和表达。
甲基化修饰还参与细胞分化、胚胎发育以及人类疾病的发生发展等过程。
3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是指通过在蛋白质上添加乙酰基团来改变其功能。
乙酰化修饰可以调节蛋白质的稳定性、亲和力和活性。
乙酰化修饰还参与细胞代谢、基因转录调控以及细胞衰老等生命过程。
4. 糖基化修饰糖基化修饰是在蛋白质上附加糖分子来改变其功能。
糖基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、折叠和识别。
糖基化修饰还参与细胞黏附、免疫应答以及疾病的发生发展等过程。
二、翻译后修饰如何改变蛋白质功能1. 调节蛋白质活性翻译后修饰可以通过改变蛋白质的结构和环境来调节其活性。
例如，磷酸化修饰可以激活或抑制蛋白质的酶活性。
2. 调控蛋白质-蛋白质相互作用翻译后修饰可以改变蛋白质与其他分子之间的相互作用。
例如，乙酰化修饰可以增强蛋白质与DNA之间的亲和力，从而影响转录调控。
3. 调整蛋白质稳定性翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性。
例如，甲基化修饰可以增强蛋白质的稳定性，延长其寿命。
4. 蛋白质定位和转运翻译后修饰可以调整蛋白质在细胞内的定位和转运。
蛋白质的修饰和表达
定向进化的应用
目标酶
所需功能
方法
结果
实施菌种
卡那霉素核苷基 转移酶
枯草杆菌蛋白酶
β-内酰胺酶 对硝基苯酯酶
胸苷激酶 β-半乳糖苷酶 砷酸脱毒途径
热稳定性
作用于有机溶 剂
作用于新底物
有机溶剂中的 底物特异性和
活性 第五特异性 基
因理疗 底物特异性
砷酸抗性
定位诱变+选择 易错PCR+选择
DNA改组+选择 易错PCR+重组
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反响条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件
• 2、pH值得变化：决定了具有潜在反响能力 的基团所处的可反响和不可反响的离子状 态。
• 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，
但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
•
• 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个 人造〔或化学修饰〕的多肽相缔合
Amps
Tetr
Tetr
Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，到达有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
5’ 3’
5’
3’ 3’
• 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反响可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。
• α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
蛋白修饰方式
蛋白修饰方式
蛋白质修饰是指在蛋白质合成后，通过化学反应或酶催化等方式对蛋白质的结构进行改变或功能进行调节的过程。
常见的蛋白质修饰方式包括：
1. 磷酸化（Phosphorylation）：通过添加磷酸基团，改变蛋白质的电荷分布和结构，从而调节蛋白质的活性、互作和定位等。
2. 乙酰化（Acetylation）：在蛋白质N-末端或赖氨酸残基上加入乙酰基，影响蛋白质的稳定性、亚细胞定位和相互作用等。
3. 甲基化（Methylation）：通过在蛋白质上引入甲基基团，调节蛋白质的结构和功能，涉及到细胞分化、基因表达和转录调控等过程。
4. 糖基化（Glycosylation）：在蛋白质上加入糖基，影响蛋白质的稳定性、溶解性和识别性，参与细胞信号传导、免疫应答等生物学过程。
5. 泛素化（Ubiquitination）：通过连接泛素分子到蛋白质上，调节蛋白质的稳定性和降解，参与细胞周期、DNA修复和免疫应答等过程。
这些是常见的蛋白质修饰方式，不同的修饰方式可以对蛋白质的结构和功能产生不同的影响，进而调节细胞内的生物学过程。
修改蛋白质表达的方法和技术
修改蛋白质表达的方法和技术在生物学研究领域中，蛋白质表达是一项关键的实验技术，它用于通过合成特定的蛋白质来研究其功能、结构和相互作用等方面。
蛋白质表达技术的不断改进和创新为科学家们提供了更多的工具和方法来满足研究需求。
本文将探讨几种常见的修改蛋白质表达的方法和技术。
一、基因工程技术基因工程技术是修改蛋白质表达的重要手段之一。
通过对目标蛋白质的基因进行改造和调整，可以实现对其表达数量、位置和时间的精确控制。
常用的基因工程技术包括基因突变、基因重组和基因剪接等。
例如，通过基因突变技术，可以对蛋白质的氨基酸序列进行改变，从而影响其功能和特性。
通过基因重组技术，可以将目标蛋白质的基因与其他有利于表达的基因进行融合，以提高其表达水平和稳定性。
基因剪接技术则可以对转录后的RNA进行修饰，实现多样化的蛋白质编码方式。
二、表达宿主的选择选择适合的表达宿主也是修改蛋白质表达的重要步骤。
常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。
不同表达宿主具有不同的特点和优势，因此，根据表达需求和目标蛋白质的性质，科学家们可以选择合适的宿主进行蛋白质表达。
大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，其优点在于生长速度快、易于培养和高效表达，尤其适合表达小到中等大小的蛋白质。
酵母则具有真核细胞的特性，可以实现真核蛋白质的表达，尤其适合复杂的酶类蛋白质。
如果需要表达大型复杂的蛋白质，如重组人蛋白等，哺乳动物细胞则是较为理想的宿主。
三、信号序列的优化蛋白质表达过程中，信号序列的优化也是一个重要的方面。
信号序列位于蛋白质的N端，可以帮助蛋白质正确地转运和定位。
合理设计和优化信号序列可以提高蛋白质的表达效率和稳定性。
一种常见的信号序列优化方法是采用强势信号序列，例如细胞质鳞片膜蛋白GFP的信号序列。
这种信号序列可以增加蛋白质在细胞内的转运速度和稳定性，提高其表达水平。
此外，还可以通过序列调整、序列插入或删除等方式，针对性地优化信号序列，以实现最佳的表达效果。
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• 非共价缔合
在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链 并不因此分开，仍能保持其生物学活性。 在变性系统中，破坏非共价键后，在非变 性基质中仍可形成原来的构型，活力也随 之恢复。这一现象可用来产生半合成的类 似物
• 产生二硫键 二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开 DTT、 二硫苏糖醇 将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一 肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌 合分子
• 形成肽键 通过酶连接反应形成肽键 从猪胰岛素生产人胰岛素 将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白 酶）
通过酶法与活性酯偶联 羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子
• 产生非天然型共价键 利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。 常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子 中的赖氨酸残基侧链相连接。
可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体 如：抗体 制备具有不同功能的F（ab)2的类似物
基于抗生素抗性“回 Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
二、蛋白质功能的全新设计
• 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的 结构和有用的功能。功能设计主要涉及键合 及催化
• 为达到这些目的可以采用两条不同的途径： 反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功 能；从头设计功能蛋白质
蛋白质的功能设计
１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能
２．键合及催化的从头设计
二、蛋白质改造的分子生物学途径
• 蛋白质改造的分子生物学方法
突变： 寡核苷酸介导的定向突变、 PCR方法、盒式突变 定向进化：异错PCR、基因家族改组技术
• 表达体系
原核表达：大肠杆菌 真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞
定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一 定长度的核苷酸片断 优点：突变率高、简单易行、重复性好 应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结 构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理 方面研究 应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导 的定点突变及盒式突变
寡 核 苷 酸 引 物 介 导 的 定 点 突 变 的 改 进
U
Kunkel方法
3’ U
U
模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶 尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株 ungdUTP酶缺陷突变体 dut-
U
转染ung+ 模板链降解
U
U 关键技术步骤：制备高质量的含U的单链DNA模板 宿主：E.coli CJ 236品系
随机突变 优点：在体外模拟自然进化的过程 常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNA family shuffling)等
寡核苷酸引物介导的定点突变
1、将待突变基因克隆到突变载体上 2、制备含突变基因的单链模板; 3、引物与模板退火，以5’端磷酸化的突变寡核苷酸引 物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双 链的DNA, 4、合成突变链:在DNA聚合酶的催化下,引物以单链DNA 为模板合成全长的互补链,而后由连接酶封闭缺口, 产生闭环的异源双链的DNA分子; 5、将异源双链DNA分子转化大肠杆菌后,产生野生型、 突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、 斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选 6、对突变基因序列进行分析
5’
3’
3’
5’ 3’ 3’
5’
5’
盒式突变
• 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突 变序列的寡核苷酸片断，取代野生型基因 中的相应序列，设计成粘性末端 • 步骤： 1、将克隆片断用限制性内切酶切割 2、将合成的寡核苷酸片断与酶切后的克隆片 断混合 3、产生突变基因产物
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件 • 2、pH值得变化：决定了具有潜在反应能力 的基团所处的可反应和不可反应的离子状 态。 • 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶， 但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造 （或化学修饰）的多肽相缔合 非共价缔合 产生二硫键 形成肽键 产生非天然型的共价键
寡核苷酸引物介导的定点突变的改进
缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲 基介导的碱基错配修复系统 改进：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA 特点:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体 2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的 步骤 3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多 对敲除/修复引物，使质粒进行多次突变
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
氧化和还原反应
• 二硫键的还原：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二 硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术。处 理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要 经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。 • 5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与 巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离 子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。 Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂， 还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状 态及跟踪构象变化的过程。
３．在全新蛋白质中引入结合位点
４．催化活性蛋白质的设计
５．膜蛋白及离子通道的设计
６．新材料的设计
第四章 蛋白质的修饰和表达
• 蛋白质修饰的化学途径 • 蛋白质修饰的分子生物学途径
氨基的化学修饰
• 三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm 和367nm能够产生特定的光吸收。 • 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。 • α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。