毕赤酵母的摇瓶发酵方法
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选【范本模板】
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1。
挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250—300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1：100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250—300r/min培养过夜(约20h）,至OD600 达到1.3～1。
5;3。
将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4。
按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5。
按步骤3 离心,用2—5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6。
按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注:可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇,就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性？菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1：1加入30％灭菌甘油，—80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O 重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：1)酶切体系（80ul)中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC,混匀2)—20℃20分钟沉淀3）13200rpm,20min，离心后弃上清4)75％乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
毕赤酵母发酵工艺手册
毕赤酵母发酵工艺手册1. 引言欢迎使用毕赤酵母发酵工艺手册。
本手册旨在介绍毕赤酵母发酵的基本原理、工艺步骤以及相关注意事项。
通过遵循本手册，您可以更好地理解和掌握毕赤酵母的发酵过程，从而在生产中取得更好的效果。
2. 毕赤酵母发酵基本原理- 毕赤酵母是一种常见的酵母菌，其发酵能力强，适用于多种发酵产品的生产。
- 发酵是指通过酵母菌对底物中的糖类进行代谢，产生酒精和二氧化碳的过程。
- 毕赤酵母在发酵过程中需要适宜的温度、pH值和营养物质等条件。
3. 毕赤酵母发酵工艺步骤1. 发酵前准备：- 准备好所需的发酵基质，包括糖类、氮源和维生素等。
- 对基质进行消毒处理，确保无害菌的存在。
2. 接种毕赤酵母：- 选择合适的毕赤酵母培养液进行接种，注意接种量的控制。
- 将毕赤酵母培养液均匀加入发酵基质中。
3. 发酵条件控制：- 控制发酵温度在合适的范围内，一般为25-30摄氏度。
- 监测发酵基质的pH值，保持在适宜的范围内。
- 提供足够的氧气供给，促进酵母的生长和代谢。
4. 发酵过程监测：- 定期对发酵过程中的温度、pH值和酵母数量等进行监测和记录。
- 根据监测结果及时调整发酵条件，确保发酵过程稳定进行。
5. 发酵结束：- 当发酵基质中的糖类被完全代谢，产物达到预期时，发酵过程结束。
- 将发酵产物经过处理和提取，得到最终的产品。
4. 注意事项- 在发酵过程中，应注意卫生和消毒，以防止杂菌的污染。
- 严格控制发酵条件，避免过高或过低的温度、pH值对发酵效果产生不利影响。
- 根据不同的发酵产品，可能需要调整发酵步骤和条件，建议根据具体要求进行调整。
- 在使用本工艺手册时，请参考其他文献和专业意见，确保准确性和可靠性。
以上是关于毕赤酵母发酵工艺手册的简要介绍。
希望本手册能对您在毕赤酵母的发酵工艺中提供帮助和指导。
如有任何问题，请随时与我们联系。
谢谢！。
常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。
10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。
500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。
100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。
10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。
10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。
过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。
LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。
毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化
70
江 西 化 工
2009 年第 1 期
表 2 不同氮源对产酶的影响
氮源 种类
牛肉膏
酵母 浸膏
蛋白胨酵蛋母白膏胨+
尿素
硫酸铵
酶活
(IU·ml - 1) 796 978 528
510
217 284
从实验结果可以看出 ,有机氮源明显优于无机氮 源 ,其中酵母浸膏可使酶活接近 1000 IU/ ml ,加之牛肉 膏价格因素 ,因此选用酵母浸膏作为氮源进行发酵 。 2. 3 正交试验
表 4 正交实验结果及分析
实验号 温度 接种量 pH
甲醇 实验 浓度 结果
1
1
1
1
1
1086
2
1
2
2
2
1509
3
1
3
3
3
1004
4
2
1
2
3
1410
5
2
2
3
1
1133
6
2
3
1
2
1308
7
3
1
3
2
1154
8
3
2
1
3
1085
9
3
3
2
1
1256
ห้องสมุดไป่ตู้
均值 1 1199. 667 1216. 667 1159. 667 1158. 333
2009 年 3 月
毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化
71
3 小结 本研究通过对毕赤酵母菌株产木聚糖酶发酵条件
进行了研究 ,得到该工程菌最佳碳源为麸皮 ,最佳氮源 为酵母膏 ,通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养 条件为 30 ℃、接种量 10 %、初始 pH5. 5 、初始甲醇含量 1. 0 % ,并确定了甲醇最佳诱导时间为 18h。该酶的耐 热稳定最高为 70 ℃。
毕赤酵母发酵罐发酵
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）灭菌前：室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）；室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定灭菌：1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。
接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。
2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
）灭菌后:A.消耗甘油阶段1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。
【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。
】5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：
一、摇瓶发酵方法: 毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；
2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMM培养基，10X的甲醇，摇瓶1L （灭菌），温控摇床，50ml 离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMG培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，
OD600=2.0-6.0 ，时间约为15-24 小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD0°=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别
加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续
诱导表达48 小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMG培养基的配制（1000ml）: 20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml; 121°C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml, 10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油100ml。
BMM培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物，加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10XYNB100ml, 10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X 甲醇100ml。
10X的甲醇的配制：取甲醇（AR上海医药集团有限公司）5ml，加入无菌水95ml，配置成5%勺甲醇溶液，用0.22卩M的微孔滤膜（millipore 公司）过滤除菌，该溶液在常温下的保质期为两个月。
10X的YNE配制方法（1000ml）:称取YNB（生化试剂，上海生物工程公司，不含
硫酸铵）34g，加入100g硫酸铵，待完全溶解后，用0.22卩M的微孔滤膜（millipore 公司）过滤除菌。
该溶液在常温下的保质期可以达1 年。
10X的磷酸缓冲液的配制方法：分别配制1M的&HPO和KHPQ,然后将132ml
的K2HPQ和868ml的KHPQ混合，调节PH至6.0 ;调PH用磷酸或者KQH然后1210C高温灭菌20min。
该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。
10X的甘油的配制方法（1000ml）：取100ml的甘油加水至1000ml，然后1210C 高温灭菌20min。
该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。
5．问：在下是初学者，关于毕赤酵母的诱导表达有些问题：
每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5〜1.0%”这里的甲醇浓度如何控
制？
还有，关于BMMY 的甲醇浓度有些材料里的是0.5% ，有的是1 .0% ，应该是哪个？“每
24h 向培养基中添加100 %甲醇至终浓度为0.5 〜1.0%”这里的甲醇浓度和BMMY 中的甲醇浓度是要一致的吗？
另外一个小问题，配10%甘油时，移入量筒的 1 00%甘油一部分会粘在管壁上，难免
最后配成的10%甘油会有所偏差，这样要不要紧？操作上是否有问题？
参考见解1 ：k4N*vx1 ~
“每24h 向培养基中添加100 %甲醇至终浓度为0.5 〜1.0%” 我可以给你解释一下：#qbk! 40Vh5o*UF
1 、它的意思是每隔24 小时，不断的添加纯甲醇（指的是甲醇试剂含有100 %甲醇，
不含有其他的成分）至终浓度为0.5 〜1.0%，指的是添加的甲醇占总体积的0.5 〜1.0%（即每100 升培养基含有甲醇0.5 〜1.0 升，如果是质量体积比则是每100 毫升培养基含有甲醇
0.5 〜1.0克）
2、只要你添加的量在以上的这个范围就可以，
当然可以根据实验的实际情况进行调整，
但是一般要在此范围内。
&m9~5k&&b@* 8w
3、配10%甘油时，注意先加入部分水后在称取甘油加入，然后在定容到所需要的体积，这样就可以避免甘油粘在管壁上，甘油易溶于水，配好后，再粘在管壁上就不会影响了。
4、建议你对实验的基础知识多多学习，你会又很大进步的！！&Gh*1AM8
参考见解2：5 44LbP9
1 、如何确保加入后甲醇浓度在此范围内？你可以进行检测啊！只要检测你的培养基中剩余的甲醇含量即可，可以计算出你应该加多少甲醇，24 小时可以检测一次。
wM7Eq&W&6RM7 0Q8M
2、至于为什么24 小时加一次，具体原因我不是很清楚，但是我觉得应该是发酵中（尤其是发酵瓶）培养基的体积太小，不能太多的取样，取样太多会影响体积、蒸发量、无菌等指标的。
而且在这个时间内酵母在甲醇终浓度为0.5 〜1.0%中生长在其许可范围内，其甲醇消耗不会超过这个范围的，时间安排也比较合理，所以可能是个经验值吧！！其实不需要考虑甲醇的消耗，只要检测它的剩余即可，根据剩余可以计算出你需要加入的甲醇体积或者
3、另外你不一定一次就加入，可以连续的在24 小时加入，不过操作就非常麻烦了，
发酵罐还可以，摇瓶怎么办呢！！2w“
4、至于一定时间从中取出1ml,这个变化应该不需要要计算进去的吧，你取样的浓度和你培养基里面的是一样的，如果这考虑进去的话，那么蒸发量、两种液体混合的体积变化、湿度等等你也要考虑，就太繁了，他们的影响很小的，没有必要计算在内。