摇瓶和发酵罐培养
青霉素发酵技术1.5 摇瓶种制作及培养(六步教学法)
教案首页授课顺序学时日期年月日班级
课
题 1.5 摇瓶种制作及培养
学习目标
学生通过查阅整理资料，结合教师讲解，学生能够理解实验室摇瓶培养原理；掌握摇瓶培养步骤；熟悉摇瓶种制作和培养工艺中的主要设备；掌握摇瓶种制作的主要工艺；熟悉摇瓶种制作中涉及的主要参数。
主要内容（1）实验室摇瓶培养原理
（2）摇瓶培养步骤
（3）摇瓶种制作主要工艺
（4）摇瓶种制作设计的主要设备（5）摇瓶种制作主要参数
教
学
过
程
1、资讯→
2、计划→
3、决策→
4、实施→
5、检查→
6、评价
教
具
或
工
具
工作任务单、多媒体设备、灭菌锅、显微镜、超净工作台等
载
体
产黄青霉培养物
考核与评价
采用工作任务单上的考核表进行评价，将评价结果记入期末总成绩，并填写教师评语部分。
轻工职业技术学院教案NO 1。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法: 毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMM培养基，10X的甲醇，摇瓶1L （灭菌），温控摇床，50ml 离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMG培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0 ，时间约为15-24 小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD0°=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48 小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMG培养基的配制（1000ml）: 20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml; 121°C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml, 10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油100ml。
BMM培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物，加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
食用菌液体菌种培养与应用技术要点
食用菌液体菌种培养与应用技术要点作者：来源：《世界热带农业信息》2024年第05期1食用菌产业发展演变食用菌栽培起始于800多年前浙江省庆元县“剁花法”原生态栽培，当时菌种靠食用菌成熟后的孢子随空气流动进行传播，其“林-菇共育系统”2022年11月4日正式入选全球重要农业文化遗产（GIAHS）保护名录。
到后来发展到“段木栽培”、“代料栽培”，就开始应用培养基培养固体菌种接种到段木上或栽培料上进行栽培，进一步提升了食用菌栽培效益和效率。
随着食用菌需求量的增加，食用菌栽培从小规模种植发展到工业化、规模化生产，食用菌菌种也随之从最早的孢子自然传播方式上升到固体菌种接种，进而发展到工厂化液体菌种生产，节省了菌种培养时间和空间，提高了食用菌栽培效率和效益。
本文主要介绍食用菌液体菌种培养与应用技术要点，以供参考。
2液体菌种与固体菌种的对比优势液体菌种是在液体培养基中利用生物发酵培育出来的食用菌菌种。
与固体菌种相比，液体菌种具有三大优势：2.1液体菌种培养原材料成本低2.1.1原材料成本低液体菌种培养基主要原料为淀粉、蛋白质、维生素等物质，相对固体菌种原料，价格较低且容易采购，如玉米淀粉，生产范围广，随处都可以就地取材，不单价格廉价而且质量稳定，既可降低生产成本又能提高培养基营养质量，培养优质菌种，降低接种时菌种的营养风险。
2.1.2贮藏空间小以杏鲍菇为例，液体菌种一般0.1 L就可以接种1个菌包，菌种贮存用空间较小，与固体菌种相比，可以节省菌种贮存空间，降低生产成本。
2.1.3生长快、培养时间短液体菌种从试管种（母种）到栽培种的培养时间一般只需要7～10 d，既缩短了菌种的培养时间，为食用菌栽培生产留足更多时间；另一方面可以减少菌种培养人工成本。
2.2液体菌种培养期间生长快液体菌种从试管种取出到三角瓶中培养最多只需要7 h就可以转入发酵罐中进行大规模培养，在发酵罐中正常情况一般只需要8～9 d，最多10 d就完全可以接入栽培料；与固体菌种相比，可以节省20 d左右的培养时间[1]。
摇瓶和发酵罐培养22页PPT
1、 舟 遥遥 以 轻飏， 风飘飘 而吹衣 。 2、 秋 菊 有 佳 色，裛 露掇其 英。 3、 日 月 掷 人 去，有 志不获 骋。 4、 未 言 心 相 醉，不 再接杯 酒。 5、 黄 发 垂 髫 ，并怡 然自乐 。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
22
干扰素分离纯化工艺流程
干扰素分离纯化工艺流程1．菌种制备取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。
然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。
2．种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。
3．发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。
然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。
同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。
或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
4．菌体收集将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。
进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。
菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。
每保存3个月，检查一次活性。
11.4.3.4 干扰素发酵过程控制在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。
而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。
可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程控制。
1．溶解氧控制分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。
通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。
2．温度控制假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。
产物合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解，而其最佳生长温度则为30℃。
摇瓶培养
一) 摇瓶培养摇瓶培养技术问世于本世纪30年代，由于其简便、实用，很快便被发展成为微生物培养中极重要的技术而普及，并广泛用于工业微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。
摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，也有旋转式和往复式的混合类型，其中以旋转式最为常用。
用旋转式摇床进行微生物振荡培养时，固定在摇床上的三角烧瓶随摇床以200～250r/min的速度运动，由此带动培养物围绕着三角烧瓶的内壁平稳地运动。
在用往复式摇床进行振荡培养时，培养物被前后抛掷，引起较为剧烈的搅拌和撞击。
振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角烧瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。
在振荡培养过程中所采用的烧瓶类型和振荡类型主要取决于所要研究的发酵类型及性质。
振荡培养通常用于有氧过程中，主要是两种类型：(1) 供氧相对较大，以产生大量的细胞，常见于丝状微生物(如食用菌、放线菌)中; (2) 需供氧但所需供氧量较小，常见于细菌。
要获得高氧供应，可在较大的烧瓶(250～500ml三角烧瓶) 中盛装相对较小容积的培养基，由此可获得更高的氧传递速率，便于细胞的迅速生长，要获得较低的氧供，则采用较慢的振荡速度和相对大的培养体积。
经连续振荡培养一段时间后，细菌等单细胞微生物可以呈均一的细胞悬液; 而丝状真菌和放线菌，可得到纤维糊状培养物——纸浆状生长。
如果振荡不足，则会形成许多球状菌团——颗粒状生长。
振荡培养技术通常用于微生物菌种的筛选或生产工艺的改良和工艺参数的优化。
因此，通常使用复合培养基。
用于振荡培养的复合培养基通常由碳水化合物及多种蛋白质性物质(玉米上清、大豆粉、豌豆粉等) 及植物油组成。
这些培养基组分以不同的速率被代谢掉，从而为微生物提供一较长的、最适生长和代谢的条件。
在复合培养基中通常还加入一些固体物质如石膏(CaCO3)，以协助培养基pH的控制并有利于絮凝物的形成，此在啤酒工艺中特别重要。
此外，经过精心设计的化学限定性培养基(避免pH 波动及防止重要培养基组分的突然耗尽)也可用于振荡培养，这类培养基的组成通常是蔗糖加酒石酸盐、铵盐、磷酸盐、金属盐类以及生长因子。
摇瓶培养的步骤
摇瓶培养的步骤咱就说摇瓶培养啊，这可是个挺有意思的事儿呢！你得先准备好你的摇瓶，这就好比是给微生物准备的一个小家。
把摇瓶洗得干干净净的，可不能有啥脏东西藏在里面，要不然微生物住得不舒服，那可不行。
然后呢，就是要配置好适合微生物生长的培养液啦。
这就好像是给它们准备的美食大餐，得营养丰富，它们才能吃得开心，长得壮壮的。
接着，把微生物小心翼翼地接种到摇瓶里。
这一步可得轻点儿，别把它们给弄伤了。
就好像是把小宝贝们轻轻地放到它们的小窝里。
接下来，就是把摇瓶放到摇床上啦。
这摇床就像是微生物的游乐场，它们可以在上面尽情地玩耍，晃来晃去的。
在培养的过程中，你可得时刻关注着它们呀。
就像照顾小朋友一样，看看它们有没有好好长大，有没有啥不舒服的地方。
温度合适不？营养够不够？这可都很重要呢。
有时候你可能会想，哎呀，这么小的微生物，我能照顾好它们吗？别担心，只要你用心，肯定没问题的。
就像你养一盆花，刚开始也会担心养不活，但只要你精心照料，它肯定会给你开出漂亮的花朵来。
而且你想想，看着这些小小的微生物在你的培养下一点点长大，那得多有成就感呀！就像你看着自己种的小树苗慢慢长成了大树，心里那叫一个美呀。
培养的时间也得把握好哦，太短了它们可能还没长大呢，太长了又怕它们累坏了。
这就跟做饭似的，火候得掌握好，不然做出来的饭可就不好吃啦。
等培养好了，就可以收获你的成果啦。
这就像是农民伯伯收获庄稼一样，满心欢喜。
总之呢，摇瓶培养虽然听起来有点复杂，但只要你一步一步认真去做，肯定能做好的。
别害怕，大胆去尝试，你会发现其中的乐趣的。
相信自己，你一定行的！咱可不能小瞧了自己呀！。
发酵综合实验 实验报告
目录摘要.................................... 错误！未定义书签。
1 引言 (4)2材料与方法 ............................ 错误！未定义书签。
3 结果与讨论............................ 错误！未定义书签。
4 总结.................................. 错误！未定义书签。
5 心得体会.............................. 错误！未定义书签。
参考文献................................ 错误！未定义书签。
蛋白酶的发酵工艺研究摘要中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。
本文对一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌（AS1.398）的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产酶的影响。
通过摇瓶培养研究碳源浓度，不同接种量对蛋白酶产量的影响。
利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。
利用发酵罐培养观察时间对产酶的影响.结果表明:豆饼粉3.0g/100ml，玉米粉4.0g/100ml，麸皮粉2.5g/100ml，磷酸氢二钠0.4g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml，pH 7.2-7.4为最适宜培养基组分。
并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。
关键词：中性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；摇瓶培养；发酵罐The Fermentation Process Research of Protease Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation ,which can be used for leather hair removal, softening, animal blood protein hydrolysis, wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment.The fermentation conditions of a Bacillus Subtilis （AS1.398） which can produce neutral protease were studied in this paper. Under the condition of different factors to examine the influence of enzyme production.This study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask. Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing time's effection on the production of enzymes. the results showed that soybean meal 3.0g/100ml, corn flour 4.0g/100ml,wheat bran powder 2.5g/100ml,disodium hydrogen phosphate 0.4g/100ml,potassium dihydrogen phosphate 0.03g/100ml, pH 7.2-7.4 was the most appropriate medium composition. Enzyme production activity of Fermentation tanks culture was higher than shaking culture. Keywords: Neutral protease；Bacillus subtilis；Shaking culture；Fermentation1 引言1.1 自然界中有大量产泌外蛋白酶微生物，其中以微生物的产酶活性最优。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1
体积氧传递系数（ 体积氧传递系数（KLa）和溶解氧的差 异
2
CO2浓度的差异 菌丝受机械损伤的差异
3
Company Logo
1
体积氧传递系数（ 体积氧传递系数（KLa）和溶解氧的差异
通气状况：
摇瓶培养：瓶塞对氧传递的阻力、表面通气状况 与周围环境有关 发酵罐培养：鼓泡通气
Company Logo
四、消除差异的方法
消除摇瓶与发酵 罐培养这两种规 模结果的差异， 模结果的差异， 使摇瓶发酵结果 能反映罐上的结 果，是一个很重 要的问题。 要的问题。
Company Logo
从下面四个方面模拟罐上发酵的条件
1 增加摇瓶机的 转速，提高摇 转速， 瓶的Kd值和 瓶的 值和 溶氧水平
Company Logo
搅拌增加菌体受损伤的程度
菌体内核酸类物质的漏出率与搅拌转速、 菌体内核酸类物质的漏出率与搅拌转速、搅拌持续 时间、搅拌叶的叶尖线速度、 时间、搅拌叶的叶尖线速度、培养液单位体积吸收的功 率以及体积氧传递系数(KLa)等成正比关系，也就是说， 等成正比关系， 率以及体积氧传递系数 等成正比关系 也就是说， 这些发酵参数的数量增加，其漏出率也增加， 这些发酵参数的数量增加，其漏出率也增加，菌体受损 伤的程度也增加。 伤的程度也增加。 虽然摇瓶发酵也有低分子核酸类物质漏出， 虽然摇瓶发酵也有低分子核酸类物质漏出，其漏出 量远远低于罐的。 量远远低于罐的。
Company Logo
LOGO
2 减少培养基的 装量，要注意 装量， 水分蒸发所引 起的误差
3 直接向摇瓶中 通入无菌空气 或氧气等措施
4 可在摇瓶中加 入玻璃珠来模 拟发酵罐的机 械搅拌来研究 因搅拌引起的 差异
Company Logo
① 在摇瓶中附加挡板也可模拟罐发酵时菌丝体的 损伤。 损伤。 为减少罐发酵对菌丝的损伤， ② 为减少罐发酵对菌丝的损伤，可采用剪切力较 小的螺旋浆式搅拌或园盘箭叶蜗轮搅拌匡， 小的螺旋浆式搅拌或园盘箭叶蜗轮搅拌匡，以及 适当减慢搅拌速度、 适当减慢搅拌速度、间断搅拌或采用气升式发酵 罐。 在对kd值或溶解氧影响不大的情况下 值或溶解氧影响不大的情况下， ③ 在对 值或溶解氧影响不大的情况下，适当增 加发酵液粘度。 加发酵液粘度。
Company Logo
主要内容 一、摇瓶实验 二、摇瓶与发酵罐培养的差异 三、摇瓶放大培养的结果 四、消除差异的方法
Company Logo
一、摇瓶实验
1、摇瓶培养 、 摇瓶培养是在菌种的筛选培养阶段（中试）， 摇瓶培养是在菌种的筛选培养阶段（中试）， 中试生产的目的是确定菌种培养的最佳操作条件， 中试生产的目的是确定菌种培养的最佳操作条件， 以便于转移到大发酵罐进行生产。 以便于转移到大发酵罐进行生产。
LOGO
摇瓶和发酵罐培养的差异
第七组
在发酵工业研究中， 在发酵工业研究中，广泛采用摇瓶试验进行 发酵条件的初步探索，为罐发酵提供参考数据。 发酵条件的初步探索，为罐发酵提供参考数据。 但摇瓶或小发酵罐的试验条件转移到大发酵罐时， 但摇瓶或小发酵罐的试验条件转移到大发酵罐时， 它们所得产物的产量往往不完全一致。 它们所得产物的产量往往不完全一致。 所以，如何尽量缩小它们之间结果的差异， 所以，如何尽量缩小它们之间结果的差异， 保证摇瓶培养为罐发酵提供可靠的试验数据， 保证摇瓶培养为罐发酵提供可靠的试验数据，就 显得十分重要。 显得十分重要。
Kd值：
溶氧系数Kd在摇瓶发酵和发酵罐中的差异很大
Company Logo
摇瓶的Kd值 摇瓶的 值
-
Company Logo
发酵罐的Kd值 值
发 酵 罐 的 溶 解 氧 都 大 于
摇 瓶
Company Logo代谢产物，同时它往往也是 是微生物的代谢产物， 合成所需的一种基质，溶解在发酵液中的CO2对 合成所需的一种基质，溶解在发酵液中的 微生物发酵有抑制或刺激作用。 微生物发酵有抑制或刺激作用。 大多数微生物适应低CO2浓度 浓度 大多数微生物适应低 0.02~0.04%体积分数）。当排出的 体积分数）。当排出的CO （0.02~0.04%体积分数）。当排出的CO2浓 度高于4%时，碳水化合物的代谢及呼吸速度下 度高于 时 影响菌体生长、形态及产物合成。 降，影响菌体生长、形态及产物合成。
Company Logo
在锥形瓶中 装入一定量 的培 养基配上瓶塞， 养基配上瓶塞， 经灭菌后接种， 经灭菌后接种， 在摇瓶上进行恒 温振荡培养。 温振荡培养。 在培养过程 中分析测定培养 液中的有关参数 和产物得量。
Company Logo
摇瓶——常压状态 常压状态 摇瓶 发酵罐——正压状态 发酵罐 正压状态
CO2在水中的溶解度随外界压力的增大而增加。 在水中的溶解度随外界压力的增大而增加。
所以罐中培养液的CO2浓度明显大于摇瓶。 浓度明显大于摇瓶。
Company Logo
三、摇瓶放大培养的结果
溶氧敏感， ① 溶氧敏感，罐中生产能力可能高于摇瓶 机械损伤敏感， ② 机械损伤敏感，罐中的生产能力低于摇瓶 溶氧和机械损伤都敏感， ③ 溶氧和机械损伤都敏感，其结果随发酵罐 中的特性而定
摇瓶试验结果提供了生产菌株的基本信息和 发酵工艺数据， 发酵工艺数据，经过中试放大后用于工厂发酵罐 生产。 生产。 摇瓶和发酵罐培养之间出现差异的原因本质 上是由这两种试验规模变化所引起的。 上是由这两种试验规模变化所引起的。
Company Logo
二、摇瓶和发酵罐培养的差异
Company Logo
3
菌丝受机械损伤的差异
摇瓶培养： 摇瓶培养：菌体只受液体的冲击或沿着瓶壁滑动 影响——机械损伤很轻 影响 机械损伤很轻
发酵罐培养：受搅拌叶的剪切力、 发酵罐培养：受搅拌叶的剪切力、搅拌时间的长 短等——机械损伤程度远远大于摇瓶培养 短等 机械损伤程度远远大于摇瓶培养
Company Logo
2、摇瓶培养的应用 、 摇瓶试验可以在有限的空间、 摇瓶试验可以在有限的空间、时间和一定量 的人力的条件下，短期内获得大量的数据， 的人力的条件下，短期内获得大量的数据，所以 在实验室研究中被广泛采用。 在实验室研究中被广泛采用。
Company Logo