分子生物学参考资料_百替生物
绍兴文理学院二○○三学年第二学期生物系生物科学专业函授01级《分子生物学》参考资料一、名词解释1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。
2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。
几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。
3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein）4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。
5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。
6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。
7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。
9．弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。
10．魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。
产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。
PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。
11．上游启动子元件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA及增强子，弱化子等。
12．DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。
13．SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。
14．单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。
15．考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。
16．蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。
当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。
称之为蓝-白斑筛选。
17．顺式作用元件：在DNA中一段特殊的碱基序列，对基因的表达起到调控作用的基因元件。
18．Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’3’外切酶活性19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。
在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。
20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。
二、填空1．DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。
2．RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。
3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。
4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。
5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。
6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（DNA重组技术）三部分。
7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。
8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，）、（mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。
9．蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法）、（可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭）。
10．蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。
11．半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。
所以需要一个不依赖于cAMP—CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP—CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。
有G时转录从（S2）开始，无G时转录从（S1）开始。
12．DNA重组技术也称为（基因克隆）或（分子克隆）。
最终目的是（把一个生物体中的遗传信息DNA 转入另一个生物体）。
典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。
②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。
③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。
④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。
13、质粒的复制类型有两种：受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制的称为（严紧型质粒），不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制称为（松弛型质粒）。
14．PCR的反应体系要具有以下条件：a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物（约20个碱基左右）。
b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。
c、dNTPd、作为模板的目的DNA序列15．PCR的基本反应过程包括：（变性）、（退火）、（延伸）三个阶段。
16、转基因动物的基本过程通常包括：①将克隆的外源基因导入到一个受精卵或胚胎干细胞的细胞核中；②接种后的受精卵或胚胎干细胞移植到雌性的子宫；③完成胚胎发育，生长为后代并带有外源基因；④利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜，培育新的纯合系。
17．杂交瘤细胞系的产生是由（脾B）细胞与（骨髓瘤）细胞杂交产生的，由于（脾细胞）可以利用次黄嘌呤，（骨细胞）提供细胞分裂功能，所以能在HAT培养基中生长。
18．随着研究的深入第一代抗体称为（多克隆抗体）、第二代（单克隆抗体）、第三代（基因工程抗体）。
19．目前对昆虫病毒的基因工程改造主要集中于杆状病毒，表现在引入（外源毒蛋白基因）；（扰乱昆虫正常生活周期的基因）；（对病毒基因进行修饰）。
20．哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件TATA、GC、CAAT所对应的反式作用蛋白因子分别是（TFIID）、（SP-1）和（CTF/NF1）。
21．RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子有、TFⅡ-A、TFⅡ-B、TFII-D、TFⅡ-E他们的结合顺序是：（D、A、B、E）。
其中TFII-D的功能是（与TATA盒结合）。
22．与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，转录因子与DNA结合的功能域常见有以下几种（螺旋-转角-螺旋）、（锌指模体）、（碱性-亮氨酸拉链模体）。
23．限制性内切酶的切割方式有三种类型分别是（在对称轴5'侧切割产生5'粘端）、（在对称轴3'侧切割产生3'粘端（在对称轴处切割产生平段）。
24．质粒DNA具有三种不同的构型分别是：（SC构型）、（oc构型）、（L构型）。
在电泳中最前面的是（SC构型）。
25．外源基因表达系统，主要有（大肠杆菌）、（酵母）、（昆虫）和（哺乳类细胞表）。
26．转基因动物常用的方法有：（逆转录病毒感染法）、（DNA显微注射法）、（胚胎干细胞法）。
三、简答1．分别说出5种以上RNA的功能？转运RNA tRNA转运氨基酸核蛋白体RNA rRNA核蛋白体组成成信使RNA mRNA蛋白质合成模板不均一核RNA hnRNA成熟mRNA的前体小核RNA snRNA参与hnRNA的剪接小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分反义RNA anRNA/micRNA对基因的表达起调节作用核酶Ribozyme RNA有酶活性的RNA2．原核生物与真核生物启动子的主要差别？原核生物TTGACA---TATAAT------起始位点-35-10真核生物增强子---GC---CAAT----TATAA—5mGpp—起始位点-110-70-253．对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。
b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。
c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。
d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。
e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件4．举例说明差示筛选组织特异cDNA的方法？制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。
例如：在肿瘤发生和发展过程中，肿瘤细胞会呈现与正常细胞表达水平不同的mRNA，因此，可以通过差示杂交筛选出与肿瘤相关的基因。
也可利用诱导的方法，筛选出诱导表达的基因。
5．杂交瘤细胞系的产生与筛选？脾B细胞+骨髓瘤细胞，加聚乙二醇（PEG）促进细胞融合，HAT培养基中培养（内含次黄嘌呤、氨基蝶呤、T）生长出来的脾B-骨髓瘤融合细胞继续扩大培养。
细胞融合物中包含：脾-脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。
骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途径利用叶酸还原酶合成嘌呤。
氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此不能生长。
骨-脾融合细胞：在HAT中能生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，骨细胞提供细胞分裂功能。
6、利用双脱氧末端终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？原理是采用核苷酸链终止剂—2，，3，-双脱氧核苷酸终止DNA的延长。
由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。
根据碱基配对原则，每当DNA 聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。
根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。
方法是分成四组分别为ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA序列。
7、激活蛋白（CAP）对转录的正调控作用？环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivated protein）。
诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响_百替生物
诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响_百替生物诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响摘要：观察诱导剂对工程菌发酵及重组目的蛋白表达的影响，从而选取最佳诱导表达条件。
本文主要阐述了几种诱导剂对工程菌发酵菌体密度以及重组目的蛋白表达量的影响，分析了不同诱导剂诱导表达重组蛋白的特点及存在的问题。
同时着重介绍了阿拉伯糖做为诱导剂对重组目的蛋白表达量的影响，研究得到工程菌发酵的最优条件，为阿拉伯糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。
关键词：IPTG;乳糖；阿拉伯糖；诱导；发酵近年来，重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术。
采用高密度发酵技术，提高菌体的发酵技术，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率，不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取，还可以缩短生产周期、降低生产成本，从而极大地提高在市场上的竞争力。
然而在研究高效发酵过程中，人们往往会遇到表达效率难以得到最大限度的提高与产率较低等问题。
在众多影响因素中，诱导剂对于外源基因高效、稳定的表达起着非常重要的作用。
由于Lac启动子是使用最早、研究最详细的启动子之一，所以目前用于诱导重组蛋白表达的诱导剂主要是IPTG和乳糖，而对阿拉伯糖诱导重组蛋白表达的研究尚少。
但有文献报道,Lac启动子的控制很不严密,在无诱导剂IPTG 的情况下可有较高的表达。
而阿拉伯糖(Ara)启动子是一个控制较严密且具较高表达水平的启动子将得到普遍应用。
1、操纵子类型及调控类型原核生物基因表达调控主要发生在转录水平上，转录调控的基本单元是操纵子。
1.1操纵子的概念根据操纵子学说，很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列，由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。
包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。
1.2乳糖操纵子——可诱导负调控乳糖操纵子的结构：由启动子（P）、操纵基因（O）、调节基因、结构基因所组成。
操纵基因I编码一个可扩散的分子,引起基因的阻遏。
DNA提取常用试剂及操作方法_百替生物
DNA提取常用试剂及操作方法一、真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
⑵离心4000g×5min，去除上清液。
⑶加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
德式乳酸杆菌百替生物
德氏乳杆菌保加利亚亚种的电转化条件优化食品科学与工程学院：张旭指导教师：崔艳华摘要：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）是最具经济价值的乳酸菌之一，在世界上广泛应用于酸奶和其它发酵乳的生产。
当前对该菌的代谢机制等方面研究甚少。
外源基因的转化效率是制约其分子代谢机制研究的重要因素。
本研究以pMG36c为材料，对L. delbrueckii subsp. bulgaricus进行电转化条件研究。
结果表明，在电转化过程中，电场强度、质粒的浓度、细胞生长状态均对转化效率有明显影响。
本研究得到该菌株的最适电转化条件为：对数初期的细胞，质粒浓度为100 ng加入到50 μl OD600为45的样品中，在10 kV/cm电场强度下电转化，转化后细胞在复壮培养液中培养3h后涂布选择性培养基，转化效率可达2.6×103 CFU/µg DNA。
关键词：德氏乳杆菌保加利亚亚种；电转化；生长时期；转化效率Abstract：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is a kind of Gram-positive bacteria, has been widely used in yogurt and other fermentation milk in the world, is recognized as the higher economic value of microorganism. The genetic transformation of L. delbrueckii subsp. bulgaricus is a key factor which restricts its genetic manipulation. The method of electrotransformation of L. delbrueckii subsp. bulgaricus CH3 was constructed by means of plasmid pMG36c. The factors were evaluated, including electric field strength,concentration of plasmid and cell growth phage. The optimum factors are the cell harvested at the early exponential growth phase, electrotransformation at the 10 kV/cm, with 100 ng plasmid per 50 μl sample, and 3h cell incubation time. The transformation efficiency is 2.6×103 CFU/µg DNA at the optimum conditions.Key words：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus electrotransformation growth phage transformation efficiency1 引言乳酸菌是一群微好氧、大多数G+C含量较低、能够发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌。
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化_百替生物
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 8学时一、实验目的使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。
二、实验原理质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。
它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在基因工程中是最常用的载体。
提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。
提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、仪器设备培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。
四、相关知识点本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。
多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。
五、实验步骤细胞培养接种培养挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
离心取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
回眸干扰素研究历程,全面认识干扰素_百替生物
回眸干扰素研究历程，全面认识干扰素缪晓辉2007年是干扰素发现50年周年。
有关干扰素的基础和临床研究涉及诸多领域，临床应用价值已经得到充分肯定，尤其是干扰素在治疗慢性病毒性肝炎的临床应用，彻底打破了慢性病毒性肝炎抗病毒治疗“无药可治”的局面，使得大量患者获益：或痊愈，或延长了寿命，或改善了生活质量。
干扰素的生物活性非常广泛，临床应用范围有待进一步拓宽。
本文对干扰素的研（究）发历程和临床应用价值作简要评述。
一、病毒学的快速发展催生了干扰素的发现病毒是一种最微小的生命物质，早年曾被定义为“可过滤因子”。
1892年Ivanowsky 发现了病毒颗粒，此后证实病毒是由核酸和蛋白质组成的、寄生于细胞的微生物。
1935年Magrassi描述了一种现象：可引起脑炎的疱疹病毒株在家兔体内能够干扰同型脑炎病毒株的生长；同年Hoskin报道猴子感染黄热病毒亲神经株后能够免除同一病毒嗜内脏株的致死作用。
此后，上述“干扰现象”不断被发现，并确认非抗体和病毒本身所为。
1957年英格兰Mill Hill实验室的Isaacs和一位瑞士访问学者Lindenmann，发现鸡胚细胞与加热灭活的流感病毒一起处理后对活的流感病毒有抵抗能力，继而从细胞上清中分离出一种蛋白质，在干扰现象（interfere）的基础上命名其为干扰素（interferon）。
从此，干扰现象的神秘面纱被揭开。
从干扰素的发现和早期的研究历程，不难理解为什么干扰素更多地被视为一种抗病毒因子。
二、干扰素是由细胞分泌的、具有广泛生物活性的细胞因子包括干扰素在内的许多具有免疫活性的蛋白质曾一度被称为淋巴因子（lymphokin），后来发现这些所谓淋巴因子可以由多种细胞产生，故至20世纪80年代初期淋巴因子逐渐被细胞因子取代，而在当时，干扰素是最重要的细胞因子。
1979年至1987年间，Gresser 担任主编，先后出版了9集《Interferon》年系列丛书集。
1980年，国际干扰素研究协会还创办了一本名为《Journal of Interferon Research》的期刊，至1994年更名为《Journal of Interferon&Cytokine Research》，可见干扰素的地位。
定量蛋白组学-百替生物
分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等
结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；
自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。由于使用的15N培养基纯度>96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。
优点：
缺点：
即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)
割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。
SILAC相对于iCAT有着更高的精确性，而且不需要复杂的化学过程和纯化步骤保证了样品相似的实验条件。
01
然而，SILAC不能用于临床的组织和血液标本。
02
新的生物标记的发现将帮助我们更好地弄清疾病致病机制和预后，用于提高早期诊断的敏感性，找到治疗靶点，弄清药物治疗作用的机制。利用上述定量蛋白组学技术精确定量正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平，进而找出二者的差异，筛选得到与疾病密切相关的差异蛋白，进而确定靶分子，为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据。
3
信号强度法：根据一级质谱相关的肽段峰强度（Mass spectral peak intensity）、峰面积（Peak area）、液相色谱保留时间（LC retention time）等信息进行定量分析；
结冷胶生物合成机理研究进展_百替生物
结冷胶生物合成机理研究进展中国生物工程杂志China Biotechnology,2005,25(11):62～65王霞袁永黎盛基许平*(山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100)摘要结冷胶是少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）产生的一种新型微生物多糖，其独特的流变特性使结冷胶具有广泛的工业用途。
虽然在结冷胶的理化特性方面的研究比较详尽，但是对结冷胶的发酵生产及其生物合成机制还缺乏深入了解。
主要关注最近在结冷胶生物合成途径分子生物学方面的研究，用于编码结冷胶生物合成所需蛋白质的基因主要有三类：与糖核苷酸合成有关的基因、与四碳重复单元合成有关的基因及与长链聚合和多糖分泌有关的基因。
基因工程是结冷胶分子改造和产量增加最具前景的方法。
关键词少动鞘氨醇单胞菌结冷胶合成途径基因工程收稿日期：2005 04 21修回日期：2005 06 20*通讯作者，电子信箱：pingxu@结冷胶是由好氧的革兰氏阴性杆菌——少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis ATCC31461发酵产生的，葡萄糖转化率为50%［1］。
这与黄原胶相比，结冷胶低产率、低转化率是限制其大规模产业化的主要障碍。
低产率、低转化率的影响因素除了环境因素（如营养物、温度、溶氧及反应器等）外，更重要的是对结冷胶的合成途径缺乏深入了解。
因此，对结冷胶生物合成机理进行分子水平上的研究对提高结冷胶产量和转化率及拓宽结冷胶应用具有重要意义。
1结冷胶的组成和结构特征结冷胶是相对分子量高达100万的阴离子型线性多糖，具有平行的双螺旋结构，其结构如图1所示［2］。
图1天然结冷胶的化学结构重复单元Fig.1Repeating unit of proposed chemical structure of crude gellan结冷胶主链结构是葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖以2∶1∶1摩尔比聚合而成的四碳重复单元的长链分子，主链上重复的四碳糖单元均为： 3) β D Glc (1 4) β D GlcA (1 4) β D Glc (1 4) α L Rha(1 。
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案_百替生物
上海中医药大学《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（4）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强上海中医药大学《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（5）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强上海中医药大学《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（6）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强实验6 组织总RNA提取实验目的1．了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如RT-PCR、Northern blot等。
2．了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。
3．获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。
4．获得某一特定组织或细胞全部RNA。
以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。
现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。
根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。
其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。
已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。
RNA主要由rRNA（占总量的80-85％），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15％）以及mRNA（占总量的1-5％）所构成。
理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。
提取总RNA的方法有多种，比如：1）本实验介绍的方法，类似于本实验的Trizol方法（今天我们会介绍这样的方法），均称为一步法，方便而快捷。
缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。
2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。
慢性疼痛的基因治疗_百替生物
慢性疼痛的基因治疗田玉科安珂华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室慢性疼痛被广泛地定义为急性组织损伤修复后疼痛持续超过1个月、疼痛持续或反复发作超过3个月以上或与组织损伤有关的疼痛预计持续存在或加重。
其中神经性痛、炎症性痛以及癌痛均可引发慢性疼痛。
剧烈或长期的疼痛会使机体各器官系统功能发生紊乱而影响生活、学习和工作。
目前慢性疼痛的治疗主要是靠给麻醉性镇痛剂和非甾体类抗炎药等，但往往带来耐药、成瘾，并涉及许多器官、系统的其他副作用。
因此寻找一种安全有效、作用持久、经济方便、副作用小的镇痛方法已成为人们感兴趣的课题。
随着细胞分子生物学的发展和基因工程技术的日臻完善，基因治疗作为一项新的生物干预手段，已被广泛应用于多种疾病的治疗与研究。
正是基于对慢性疼痛的分子生物学机制有了更加深入的了解，人们才有可能在基因水平上探讨其治疗，为疼痛治疗开辟了一条新的途径，目前疼痛的基因治疗途径有两种，现就此方面的研究现状作一简要介绍。
1、间接体内疗法（Ex vivo Gene Therapy）该疗法也称作细胞移植疗法，是早期疼痛基因治疗最常用的，被认为是一种接近于生理的、有效的镇痛方法。
它是基因治疗与移植技术相结合的方法，其要点是选择合适的基因、靶细胞及最有效的基因转移方法。
1.1机理基于疼痛时内源性抑制信息的不足，包括5-羟色胺、去甲肾上腺素、γ-氨基丁酸（GABA）、内源性阿片肽如β-内啡肽、脑啡肽、强啡肽以及内源性甘丙肽和神经营养因子如脑源性神经营养因子（BDNF）等。
该方法是将体外培养的某些细胞株移植入体内，这些类似于“生物微泵”的移植细胞在中枢神经系统（脊髓）持续分泌、缓释多种抗痛蛋白分子、抗痛蛋白调控因子、酶类或信号转导因子，从而增强局部抗痛蛋白的表达，降低疼痛敏感性，产生良好的镇痛效果，避免了全身给药带来的副作用，目前研究最多和最深入的是嗜铬细胞移植和基因工程细胞移植。
1.2嗜铬细胞移植动物实验和临床研究显示,将同种或异种嗜铬细胞移植于机体的特定部位,可提高宿主对疼痛的耐受性,产生镇痛效应。
动物肝脏DNA的提取及检测_百替生物
５．核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型 DNA 的移动速度次序为：共价闭环 DNA＞直线 DNA＞开环的双链环状 DNA。 ６．琼脂糖凝胶电泳的特点 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖 （ agarose ，约占 80% ）及琼脂胶（ agaropectin ）组 成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质， 不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸 性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能 产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质 作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用 琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 ①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 ②琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98%~99%） ，近似自由电泳，样品扩散较自由 电流， 对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 ③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 ④电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 ７．常用染料 EB（溴化乙锭 Ethidium Bromide，EB） ： 溴乙锭染料全名是 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐，是诱变剂，可与核酸结合，在紫外光下 呈黄色荧光。使用时一定要戴手套。 EB 废液要经过处理才能丢弃。 ①在 300nm 波长的紫外光照射下发出荧光。在适当的下，荧光强度与 DNA 片段的大小(或数量) 成正比。 可插入碱基与碱基之间造成移码突变。 DNA（RNA）定量 分析：可用紫外光谱 分析，原理是 DNA（RNA）分子在 260 nm 处 有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与 DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼 脂糖凝胶电泳上显示的 DNA（RNA）带的亮 度来分析，因为 EB 作为一种荧光染料，能插 入 DNA(RNA) 的碱基对平面之间而结合于其 上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上 EB 的量与 DNA 分子的长度和数量成正比。在电 泳时加入已知浓度的 DNA（RNA）Marker 作为 DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品 DNA(RNA) 的荧光强度就可以大致 表示 DNA（RNA）量的多少。 ８．提纯的思路 ①基因组 DNA 的特性：分子量较大、所提取的 DNA 片段的大小：100 — 150kb，易断（如何保证 DNA 分子的完整性？） ②组织和细胞的破碎 ③要去除的物质： 蛋白、多糖、脂类、RNA 和小分子物质