产酶海洋微生物的筛选
产壳聚糖酶海洋真菌鉴定、寡营养培养基优化及廉价培养基研究
产壳聚糖酶海洋真菌鉴定、寡营养培养基优化及廉价培养基研究朱利平;黄惠莉【摘要】A chitosanase-producing marine strain was isolated by our laboratory. Identification by rDNA - ITS sequence analysis, and it is Penicillium oxalicum. This is the first time that Penicillium oxalicum＇ s the ability of producing chitosanase is reported. For the purpose of fermentation chitosanase in industrial, we studied oligotrophic medium components, such as source of carbon, nitrogen source, saltresistance, acidresistance and rotary speed. We explored different kinds of cheap medium for production of chitosanase. We found the soybean powder was the best, and the medium of soybean powder was as follow （g/L seawater）： soybean powder 25 g, and the optimal enzyme activity was 8.5 U/mL. This medium was insufficient 5% of the cost of original. It provided direct theory and experiment foundation on industrialized production of chitosanase.%对筛选出的产壳聚糖酶海洋真菌进行了rDNA—ITS序列分析技术鉴定，确定该菌为Penicillium oxalitun，这是首次报道该菌属具有产壳聚糖酶的能力。
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化
作者简介： 崔洪霞 （ 】 ９ ７ ７ 一 ） ，女，黑龙江 尚志人，博： 士，副教授 ，主要研究方 向为微生物与生化药学，Ｅ ｍａ ｉ ｌ ：ｈ ｘ ｃ ｕ ｉ ＠ｙ ｓ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． Ｃ ／ Ｉ 。
一
株 高产碱性蛋 白酶海洋细菌 的筛选及 发酵条件 的优化
崔洪 霞 。 ’ ，李春 林 ，钱 龙 ，孙 滢 ，周艳艳 ，史云柯
（ １ ． 燕 山大学 环境 与化 学工程学 院，河北 秦 皇岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；２ ． 河北省应用化 学重点 实验 室，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；３ ． 燕山大学 里仁学院 ，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ）
酶 的 强 弱顺 序 为 ：ｐ Ｈ 值 、培 养 时 间 、接 种 量 、装 液 量 ，菌 株 Ｓ ＤＬ ９在 较 佳 发 酵 条 件 下 的发 酵 液 的 最 大 酶 活 力 达 １ ９ ７ ． ５ ８ Ｕ／ ｍＬ。本 研 究 表 明 从 秦 皇 岛海 域 可 以获 得碱 性 蛋 白酶 高产 菌株 ，丰 富 了菌 种 资源 。
关键词：碱 性蛋 白酶；筛选 ；海泥 ；菌株 Ｓ ＤＬ ９ 中图分类号：Ｑ９ ３ ９ 文献标识码 ：Ａ ＤＯＩ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ７ — ７ ９ １ Ｘ ． ２ ０ １ ３ ． ０ １ ． ０ １ ５
０ 引言
近 年来 ， 碱 性蛋 白酶 由于与传 统 的化 学催化剂 相 比具有 催化 能力强 、底物专 一性 高等优 点，已被 广泛 应用于制 革 、银回收 、医药 、食 品、饲 料 、化 学工业 、废物 处理等生产 及行业 。其最 早发现 于 猪胰 脏 中， 而 １ ９ ４ ５年又 发现于地 衣芽孢 杆菌 中 ， 开辟 了微生 物碱性 蛋 白酶 的来源 。 在碱 性蛋 白酶的
海洋微生物活性物质
xx微生物活性物质的研究进展专业：生物工程姓名：李振森学号：02海洋是生命的发源地，约占地球表面积的71%，其中生物种类20多万种，其多样性远远超过陆地生物的多样性。
由于海洋环境具有高盐度、高压、低营养、低温和无光照等条件，从而形成了海洋生物与陆地生物不同的生长方式和代谢系统。
近年来，随着人们对海洋生物研究的不断深入，发现了多种多样的生物及许多具有新颖、特异化学结构的生物活性物质。
海洋生物活性物质主要包括生物信息物质、生理活性物质、海洋生物毒素及生物功能材料等。
目前，从海洋生物中已相继发现300余种新型化合物，结构新颖并具有多样性：有枯类、聚醚类、当醇类、皂昔类、生物碱、多糖、小分子肤、核酸及蛋白质等，并具有丰富的生理及药理活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒、防治心血管疾病、延缓衰老及免疫调节等多种功能。
多年来，国内外一直致力于这方面的研究，试图从中开发结构明确，疗效肯定的新型生物活性物质，以用于攻克人类面临的重大疑难疾病，其中具有高生物活性和高选择性的海洋生物毒素备受重视，成为研究的热点。
近年来，海洋生物毒素是海洋生物活性物。
1、xx抗肿瘤活性物质1.1xx放线菌海洋有着极其丰富的放线菌资源，具有抗菌活性的海洋微生物中约有45%来源于放线菌。
就目前的报道，海洋放线菌产生的活性物质大部分来源于小单孢菌属和链霉菌属。
由于海洋放线菌所产生的代谢产物具有功能独特、结构新颖等特点而受到人们的广泛关注，例如抗真菌、抗疟等功能。
另一方面，陆生放线菌的不断开发，发现新的活性物质的可能性越发减少，迫使人们将目光转向海洋放线菌的开发。
1991年Fenical小组［1］首次发现一属全新的需盐生长的特殊海洋放线菌Salinispora，其广泛存在于热带和亚热带海泥中。
2003～2005年Fenical小组从［－］菌株Salinispora tropicaCNB-392中分离得到10个结构新颖的化合物24，其中化合物Salinosporamide A(1)［3］具有广阔的成药前景，对人结肠癌细胞的IC50为［5－6］0．035nmol /L，已作为癌症药物进入临床前研究。
大连海域海洋功能细菌的筛选
大连海域海洋功能细菌的筛选王倩倩;刘玮;刘春莹;迟乃玉;张庆芳;于爽【摘要】从大连海域采集30余种海洋样品,用海水2216E固体培养基、含亚甲基蓝的固体培养基、含碳酸钙的固体培养基等进行培养,初筛出100多株具有产酸、产酶、产抗氧化性物质的菌株;20℃培养48 h,复筛出12株繁殖力强的低温菌,对其进行生长量检测、革兰氏染色、产酸、产葡萄糖氧化酶、亚硝酸盐降解、硝酸盐分解及10℃低温培养.其中菌株M2,5,6,4-1,7-1耐低温、生长快、产酸高、降解亚硝酸能力强、不分解硝酸盐、革兰氏阳性,兼性厌氧,初步确定为低温乳酸菌.同时还筛选出40余株具有葡萄糖氧化酶特性的菌株以及其他特性菌株,并对筛选的近200株海洋菌株进行保藏.该研究进一步证明了海洋微生物种类的多样性,使人们对未知的海洋微生物世界的研究更加着迷.【期刊名称】《科技创新与生产力》【年(卷),期】2019(000)006【总页数】4页(P42-45)【关键词】海洋微生物;细菌;细菌筛选;细菌保藏【作者】王倩倩;刘玮;刘春莹;迟乃玉;张庆芳;于爽【作者单位】大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622【正文语种】中文【中图分类】Q93-33浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，海洋特有的环境造就了海洋微生物的多样性与独特性，据估计，海洋微生物可达2 亿种。
微生物酶筛选的一般流程
微生物酶筛选的一般流程英文回答：Microbial enzyme screening typically involves several steps to identify and select enzymes with desired properties. Here is a general process that is commonly followed:1. Identification of target enzymes: The first step is to determine the specific enzyme activity that is of interest. This could be based on the desired function or the ability to catalyze a specific reaction.For example, let's say we are interested in finding enzymes that can degrade cellulose for biofuel production.2. Source selection: Once the target enzyme is identified, the next step is to select a suitable microbial source that is likely to produce the desired enzyme. Microbes such as bacteria, fungi, and yeast are commonlyused sources.Continuing with our example, we could choose to screen cellulose-degrading enzymes from a variety of fungi known for their ability to break down plant material.3. Isolation and cultivation: The selected microbial source is isolated and cultivated under controlled conditions to optimize enzyme production. This may involve growing the microbe on specific media or in specialized bioreactors.In our case, we would isolate the chosen fungi and cultivate them in a nutrient-rich medium that promotes cellulase production.4. Enzyme extraction: Once sufficient enzyme production is achieved, the next step is to extract the enzymes from the microbial culture. This can be done through various methods such as centrifugation, filtration, or precipitation.For example, we could use centrifugation to separatethe fungal cells from the culture broth, and then collectthe supernatant containing the secreted enzymes.5. Enzyme screening: The extracted enzymes are then screened for the desired activity. This can be done through various assays and tests that measure the enzyme's abilityto catalyze the desired reaction.In our case, we could perform assays to measure the ability of the extracted enzymes to break down celluloseinto glucose.6. Enzyme characterization: Enzymes that show promising activity are further characterized to determine their properties. This may include studying their optimal pH and temperature range, stability, substrate specificity, and kinetic parameters.For example, we could determine the optimum temperature and pH at which the cellulase enzyme functions best, aswell as its ability to degrade different types of cellulose.7. Optimization and engineering: If needed, the selected enzyme can be further optimized or engineered to improve its properties. This can be done through techniques such as protein engineering or directed evolution.In our case, we could use protein engineering to modify the cellulase enzyme to make it more efficient in breaking down cellulose.8. Scale-up and production: Once the desired enzyme is identified and optimized, it can be scaled up for large-scale production. This may involve transferring the enzyme-producing strain to industrial fermentation systems and optimizing the production process.For example, we could transfer the selected fungal strain to a large-scale bioreactor and optimize the fermentation conditions for maximum cellulase production.Overall, the process of microbial enzyme screening involves identifying the target enzyme, selecting asuitable microbial source, isolating and cultivating the microbe, extracting and screening the enzymes,characterizing and optimizing the selected enzyme, andfinally scaling up production.中文回答：微生物酶筛选通常包括几个步骤，以确定和选择具有所需特性的酶。
酶工程2-2 常用的产酶微生物
3. 红曲霉(Monascus)
• 红曲霉: 菌落初期白色, 老熟后变为淡粉色、紫 红色或灰黑色,通常形成红色色素。菌丝具有隔膜, 多核, 分支甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分支 的顶端, 单生或成链, 闭囊壳球形, 有柄, 其内 散生10 多个子囊, 子囊球形, 内含8 个子囊孢子, 成熟后子囊壁解体, 孢子则留在闭囊壳内。
细 菌
1. 大肠杆菌( Escherichia coli)
• 形态：呈杆状, 有的近似球状, 大小为0. 5μm ×1～3 μm , 一般无荚膜, 无芽孢, 运动或不运动, 运动者周生鞭毛。菌 落从白色到黄白色, 光滑闪光, 扩展。
• 革兰氏染色阴性。 • 产生的酶一般都属于胞内酶, 需要经过细胞破碎才能分离 得到。 • 采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、D N A 聚合酶、 D N A 连接酶、核酸外切酶等, 在基因工程等方面广泛应 用。
• 枯草杆菌是应用最广泛的产酶微生物, 可以用于生产α-淀 粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5′-核苷酸酶和碱性磷酸酶 等。 例如,枯草杆菌BF7658 是国内用于生产α-淀粉酶的 主要菌株;枯草杆菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸 酶。 • 枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶, 而其产 生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。
霉 菌
1. 黑曲霉( Aspergillus niger)
• 是曲霉属黑曲霉群霉菌。
• 菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成, 菌丛黑褐色, 顶囊大球形, 小梗双层, 分生孢子球形, 平滑或 粗糙。 • 黑曲酶可用于生产多种酶, 有胞外酶也有胞内酶。 例如, 糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪 酶、纤维素酶、橙皮苷酶和柚苷酶等。
第二章 产酶微生物的分离与筛选
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
菌体从椭圆至杆状，单个、 成对或成链，革兰氏阴性， 运动（周毛）或不运动， 不生芽孢。好气。含糖、 乙醇和酵母膏的培养基上 生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡 萄糖异构酶(高果糖浆 )山 梨糖 (维C中间体）
(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2. 化学诱变剂
(1) 与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺 烷化剂(alkylating agent)： 带有一个或多个活性烷基， 带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分 别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至 其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其 与DNA中的碱基或磷酸作用。 常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲 基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
2.3.2 突变株的分离与筛选
突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条 件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定 的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的 特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原 养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是 决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以 充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培 养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、 浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。 同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一 致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。
2.2.4 初筛
1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法
2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法
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产酶海洋微生物的筛选
前言：浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，它覆盖着地球表面积的71%，海水总体积占地球总水量的97%。
全球80％以上的物种蕴藏于海洋中，由于独特的生存环境（如高压、高渗、高温、低温等复杂多变的生态环境）及海洋生物物种间的生态作用远比陆生物种复杂和广泛，因此赋予海洋生物均活性远比陆生生物要强，尤其重要的是有些海洋生物活性物质的结构与陆生生物化合物不同，表现出独特的活性，作为产酶资源就具有了突出的特点和优势。
人们从海洋环境中已经分离的到各种极端酶，如嗜冷酶、嗜热酶、嗜压酶、嗜盐酶等，由于具有广泛的适应性，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。
1 材料与方法
1.1样品采集
从连云港海域采集
1.2培养基
1.2.1细菌培养基
蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂20g 陈海水1000ml，pH 7.4-7.6
1.2.1.1细菌富集培养基
将1.2.1的细菌培养基去掉琼脂
1.2.1.2产淀粉酶细菌筛选培养基（初筛）
将1.2.1的细菌培养基加入2%的可溶性淀粉
1.2.1.3产右旋糖酐酶的细菌筛选培养基（初筛）
将1.2.1的细菌培养基加入1%的右旋糖酐
1.2.1.4产淀粉酶发酵培养基（复筛）
将1.2.1.2的培养基去掉琼脂
1.2.2放线菌培养基
可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，MgSO4∙H2O 0.5 g, KNO3 1 g，K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.01 g，琼脂20 g ，陈海水1000mL，pH7.4～7.6。
注：在制备平板时培养基融化后加入：重铬酸钾80mg∙/L
1.2.3真菌培养基
马铃薯去皮，取200g切成小块，加50%陈海水煮沸30min，4-6层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂20g，溶化后再用陈海水定容至1000mL ，pH7.2～7.4。
注：在制备平板时培养基融化冷却至60℃后加入：青霉素50mg∙/L，链霉素50mg∙/L
1.3菌株筛选方法
将样品分别放入四类微生物富集培养基中，25℃，180rpm, 培养48h。
然后将富集培养基10倍递增稀释，取适宜稀释倍数的培养液涂布于3种培养基琼脂平板中，25℃培养（培养时间由菌生长情况而定）。
将培养出的菌落进行分离培养，将纯的单菌落进行斜面保藏。
1.4产酶菌株的筛选
将菌株分别点种到产酶筛选培养基中，25℃，培养72h。
于淀粉酶筛选平板
直接加入适量碘液，观察透明圈的存在与否及大小；于右旋糖酐筛选平板上加入95%的乙醇，置于-20℃冰箱，24h后观察透明圈的存在与否及大小。
1.5菌株产淀粉酶的测定
1.5.1菌株的产酶
将产生透明圈最大的菌株接入产酶培养基中，25℃，180rpm，培养24h。
1.5.2淀粉酶酶活力的测定
1.5.
2.1麦芽糖标准曲线的制备
取7支25mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的麦芽糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同麦芽糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线的制作
管号麦芽糖标准液
（mL）蒸馏水
（mL）
DNS
（mL）
麦芽糖含量
（mg）
0 0 2 2.0 0
1 0.
2 1.8 2.0 0.2
2 0.4 1.6 2.0 0.4
3 0.6 1.
4 2.0 0.6
4 0.8 1.2 2.0 0.8
5 1.0 1.0 2.0 1.0
6 1.2 0.8 2.0 1.2
摇匀，沸水浴10min，取出，冷却，加蒸馏水10mL，混匀，调波长520nm，用0号管调零点，比色。
以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量（mg）为横坐标，做标准曲线。
1.5.
2.2酶活力测定方法
底物（1%淀粉溶液）：称取1g淀粉溶于100ml 0.05mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
表2 样品的测定
样品空白 1.0 1.0
样品 1.0 1.0
将样品于25℃水浴反应30min(样品空白不参加水浴反应)，然后将样品空白和样品每管加入2mlDNS试剂，沸水浴反应10min，冷却，各加蒸馏水10ml，混匀，测520nm处的吸光值，从标准曲线上查出麦芽糖的含量。
1.5.
2.3酶活力单位定义
在一定条件（25℃30min）下，1min催化产生1 g麦芽糖的酶量，即为一
个酶活力单位。
1.6菌株的初步鉴定
1.6.1菌株的形态特征
观察菌落形态和大小，对细菌进行特殊结构染色，并进行显微摄影。
1.6.2细菌的生理生化特性
接种：用接种环从斜面上挑取透明圈最大的菌株接种于安培瓶中。
25℃培养。
表3 细菌微量生化鉴定管的使用
注：培养结束后，添加相应的试剂，观察判断结果。
1.7NaCl浓度对细菌生长的影响
配制NaCl浓度（%）分别为0,1.5，3.0，4.5，6.0，7.5，10的2216E液体培养基（蒸馏水配制）各两只，并留一只不接种作为对照，一支接种不培养作为初始浓度对照。
分装于试管中，装液量为5ml,121℃灭菌20min。
在不同浓度NaCl培养基中以4％接种量接入菌悬液，25℃，180rpm，培养24h。
2. 结果与讨论
2.1菌落特征
表4 菌落特点
2.2菌株的产酶特性
对透明圈进行描述，并拍照。
2.3NaCl浓度对细菌生长的影响
以菌体生长量（OD600）为纵坐标，NaCl浓度（%）为横坐标做生长曲线图，得出最适该菌生长盐度。
2.4细菌的生理生化特性
表6 生理生化性质鉴定结果
2.5 淀粉酶酶活力测定
2.5.1 麦芽糖标准曲线
2.5.2 酶活力计算
参考文献：
[1]李艳华，张利平。
海洋为生物资源的开发与利用。
微生物学通报。