蛋白质与酶工程 第二章 微生物发酵产酶.
酶工程 考试重点
第二章微生物发酵产酶名词解释酶生物合成的诱导作用：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象酶生物合成的反馈阻遏作用：又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象分解代谢物阻遏作用：是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象判断组成酶or诱导酶受什么阻遏固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞固定化原生质体：是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行新陈代谢的原生质体原生质体：是除去细胞壁后由细胞膜及包内物质组成的微球体。
原生质体由于除去细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外，可以用于胞内酶等胞内产物的生产。
问答题何为细胞产酶动力学，简述其动力学模型产酶动力学主要研究发酵过程中细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响规律，主要为宏观产酶动力学。
根据细胞产酶模式的不同，产酶速率和细胞生长速率的关系也有所不同。
1)同步合成型的酶：其产酶与细胞生长欧联，在平衡期产酶速率为零，即非生长偶联的比产酶速率β=0 方程： dE /dt=αμX2)中期合成型的酶：在培养液中有阻遏物存在，α=0，无酶产生。
在此阶段的产酶动力学方程与同步合成型相同3)滞后合成型：其合成模式为非生长偶联行，生长偶联的比产酶系数α=0 方程： dE/dt=βX4)延续合成型的酶：在细胞生长期和平衡期均可以产酶，产酶速率是生长偶联与非生长偶联产酶速率之和（最理想状态）方程： dE /dt=αμX+βX受mRNA抑制的模型：1）、2）原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，与酶的生物合成密切相关的基因有4种：调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。
结构基因与操纵基因、启动基因一起组成操纵子。
原核生物中有两种类型操纵子：诱导性，如乳糖操纵子；阻遏型操纵子，如色氨酸操纵子。
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
酶工程考试重点
第一章：绪论◆酶：由生物体产生的具有生物催化功能的生物大分子，按照分子中起催化作用的主要组分的不同，自然界中天然存在的酶可以分为蛋白类酶（protein enzyme)和核酸类酶◆酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程◆锁与钥匙学说：底物结构必须与酶活性部位的结构非常互补，就像锁与钥匙一样，这样才能紧密结合，形成酶-底物复合物。
这个学说可以解释酶的绝对专一性，但是不能解释酶的相对专一性。
◆诱导契合理论：酶分子活性中心的结构并不与底物分子的结构互补,但活性中心有一定的柔性，当底物分子与酶分子相遇时可以诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性中心的各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向，从而使酶与底物互补结合，产生酶-底物复合物，并使底物发生化学反应◆中间产物学说：酶首先与底物结合成酶-底物复合物，然后转变成酶-过渡态中间物复合物，然后，生成酶-产物复合物，最后从酶分子上释放产物，从而大大降低反应的活化能（分子由基态转变为过渡态即活化态所需的能量）。
◆Km 值是当酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度◆竞争性抑制：抑制剂竞争性与酶的活性中心结合，从而阻止底物与酶的结合。
这是最常见的一种可逆抑制作用。
随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。
Vm 不变，Km 增大◆非竞争性抑制：底物和抑制剂可以同时与酶结合，抑制剂结合于活性中心以外的部位，两者没有竞争作用，但影响产物的释放，Vm 降低，Km 不变◆反竞争性抑制Vm 降低，Km 减小◆酶活力：酶催化底物发生化学反应的能力。
测定酶活力，实际上就是测定酶促反应进行的速度。
酶促反应速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。
◆酶的比活力：每毫克酶蛋白（酶制剂）所含的酶活力单位数称为酶的比活力，用U／mg 蛋白表示。
酶的比活力是酶制剂的一个纯度指标。
对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶纯度愈高。
◆酶的生产方法：.提取分离法；生物合成法；化学合成法第二章：微生物发酵产酶结构基因、操纵基因与启动基因一起组成操纵子，分为诱导型与阻遏型。
酶工程期末重点
酶工程期末复习第一章绪论1、酶是具有生物催化功能的生物大分子，分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）。
2、酶的生产（enzyme production）是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程。
3、酶的改性（enzyme improving）是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰，酶固定化，酶的非水相催化和酶定向进化等。
4、酶的应用（enzyme application）是通过酶的催化作用获得人们所需的物质，除去不良物质或者获取所需信息的技术过程。
5、酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。
单位是国际单位IU或卡特（kat）6、酶的比活力（specific activity）是酶纯度的亮度指标，是指在特定条件下，单位重量蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。
7、酶的生产方法可以分为提取分离，反生物合成法和化学合成法三种。
（1）何谓酶工程，试述其主要内容和任务酶工程是指酶的生产、改性和应用的技术过程酶工程的主要内容包括微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶、酶的提取与分离纯化、酶分子修饰、酶固定化、酶的非水相催化、酶定向进化、酶反应器、酶的应用主要任务：经过预先设计，通过人工操作，优质生产获得人们所需的酶，并通过各种方法改进酶的催化特性，充分发挥其催化功能，对酶进行高效应用（2）酶有哪些显著的催化特性？专一性强、催化效率高、作用条件温和（3）简述影响酶催化作用的主要因素底物浓度（主要）、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度（4）简述酶活力单位的概念和测定酶活力的基本步骤-酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25℃，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1微摩尔的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。
基本步骤：(1)根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。
(2)根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件(3)在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。
酶工程重点整理总结
.第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。
答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（10~10倍）；137（3）酶催化作用条件温和。
3、简述影响酶催化作用的主要因素。
答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。
酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。
（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。
一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。
（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。
（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。
如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。
5、简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
答：概念：在特定条件下（温度可采用25°C，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol 的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU）。
酶工程 考试重点
第二章微生物发酵产酶名词解释酶生物合成的诱导作用：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象酶生物合成的反馈阻遏作用：又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象分解代谢物阻遏作用：是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象判断组成酶or诱导酶受什么阻遏固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞固定化原生质体：是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行新陈代谢的原生质体原生质体：是除去细胞壁后由细胞膜及包内物质组成的微球体。
原生质体由于除去细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外，可以用于胞内酶等胞内产物的生产。
问答题何为细胞产酶动力学，简述其动力学模型产酶动力学主要研究发酵过程中细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响规律，主要为宏观产酶动力学。
根据细胞产酶模式的不同，产酶速率和细胞生长速率的关系也有所不同。
1)同步合成型的酶：其产酶与细胞生长欧联，在平衡期产酶速率为零，即非生长偶联的比产酶速率β=0 方程： dE /dt=αμX2)中期合成型的酶：在培养液中有阻遏物存在，α=0，无酶产生。
在此阶段的产酶动力学方程与同步合成型相同3)滞后合成型：其合成模式为非生长偶联行，生长偶联的比产酶系数α=0 方程： dE/dt=βX4)延续合成型的酶：在细胞生长期和平衡期均可以产酶，产酶速率是生长偶联与非生长偶联产酶速率之和（最理想状态）方程： dE /dt=αμX+βX受mRNA抑制的模型：1）、2）原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，与酶的生物合成密切相关的基因有4种：调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。
结构基因与操纵基因、启动基因一起组成操纵子。
原核生物中有两种类型操纵子：诱导性，如乳糖操纵子；阻遏型操纵子，如色氨酸操纵子。
酶工程微生物发酵产酶
2、控制阻遏物浓度 微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不致于引起分解代谢物阻遏的浓度。
3、添加表面活性剂 在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机理尚未搞清；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的反馈平衡，提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如在霉菌的发酵生产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。
第三节 发酵工艺条件及其控制
保藏细胞 ↓ 细胞活化 ↓ 原生质体←细胞扩大培养→固定化细胞 ↓ ↓ ↓ 固定化原生质体 →发酵 预培养 ↓ 培养基 分离纯化 无菌空气 ↓ 酶
六、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。一般可分为三类： ①酶的作用底物，例如乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的生成，青霉素是青霉素酚化酶的诱导物。 ②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。 ③酶的底物类似物，例如异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对ß-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。
5、高产菌株的选育 目前，优良菌种的获得一般有三条途径：一是从自然界分离筛选；二是用物理或化学方法处理、诱变；三是用基因重组或细胞融合技术。
5、常用的产酶微生物
（1）细菌 大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。大肠杆菌可生产多种酶，如，谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。 枯草杆菌：用途很广，可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。 （2）放线菌 链霉菌：； ②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性； ③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等； ④作为自养菌的能源。 当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。 在微生物的发酵生产中，应特别注意有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的。
酶工程期末小结 - 小字
1 酶是具有生物催化功能的生物大分子, 按照其化学组成, 可以分为蛋白类酶(P 酶) 和核酸类酶( R 酶) 两大类别。
蛋白类酶主要由蛋白质组成, 核酸类酶主要由核糖核酸( R N A ) 组成。
2 酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的主要内容包括: 微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶, 酶的提取与分离纯化, 酶分子修饰, 酶、细胞和原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用。
酶工程的主要任务是经过预先设计, 通过人工操作, 获得人们所需的酶, 并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能的技术过程。
3 酶是生物催化剂, 与非酶催化剂相比, 具有专一性强, 催化效率高和作用条件温和等显著特点。
4 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、p H 值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。
在酶的应用过程中, 必须控制好各种环境条件, 以充分发挥酶的催化功能。
5 根据国际酶学委员会的建议, 每一种具体的酶都有其推荐名和系统命名。
6 。
酶的推荐名一般由两部分组成: 第一部分为底物名称, 第二部分为催化反应的类型。
后面加一个“酶”字(-ase)。
不管酶催化的反应是正反应还是逆反应, 都用同一个名称。
例如, 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase), 表明该酶的作用底物是葡萄糖, 催化的反应类型属于氧化反应。
7 酶的系统命名则更详细、更准确地反映出该酶所催化的反应。
系统名称(syste m atic na m e) 包括了酶的作用底物、酶作用的基团及催化反应的类型。
8 酶活力是指在一定条件下, 酶所催化的反应初速度。
在外界条件相同的情况下, 反应速度越大, 意味着酶活力越高。
9 1961 年国际生物化学与分子生物学联合会规定: 在特定条件下(温度可采用25℃, p H 值等条件均采用最适条件), 每1 min 催化 1 μm ol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位, 这个单位称为国际单位(I U )。
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2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是 以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物 中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由 1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物 中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶 Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目 为4～10个，亚基种类有4～6种。
三个终止密码: UAA
UGA
UAG
多数氨基酸拥有 2-4个密码
遗传密码的性质
1 密码的连续性 起始密码子决定所有后续密码子的位置。
2 密码的简并性
由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并， 对应于同一种氨基酸的几个密码子称为同义密码子。
• 同义密码子第一、 第二位核苷酸往往 是相同的，而第三 位核苷酸的改变不 一定影响所编码的 氨基酸。 • 一般说来，编码某 一氨基酸的密码子 越多，该氨基酸在 蛋白质中出现的频
Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus …… Plant cell culture Animal cell culture
Few example来自节 目录3、蛋白质的合成(翻译)-Translation
翻译: 以mRNA为模板，以各种氨基酸为底物，
在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅因子的作用，
合成多肽链的过程，称为翻译
翻译 mRNA 各种信息 蛋白质 各种蛋白质
（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）
蛋白质合成的几个要素-mRNA(模板，template)
Contents of chapter 2
Go
1、酶生物合成过程 2、常见产酶微生物 3、酶的发酵工艺条件及控制 4、酶生物合成的模式
Go
Go
Go
5、动植物细胞培养产酶，自学
2.1 酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme
Go
1、中心法则- Central Dogma 2、RNA的生物合成- Transcription 3、蛋白质的生物合成- Translation 4、酶生物合成的调节- Regulation
率也越高（精氨酸
Arg是个例外）。
转录过程
起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸 elongation 转录终止 termination
转录后加工 modification
Enzyme assembly, promoter recognition, activator binding
mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。 以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就 是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中 的氨基酸排列顺序。
蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codon
mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种 氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。 四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。其中： 一个起始密码: AUG
Possible catalytic subunits
Role unknown (not needed in vitro)
151 155 36.5 kDa 11 kDa
Promoter specificity
(32-90 kDa)
The E. coli RNA polymerase holoenzyme consists of six subunits: a2bb’ s.
Go
Go
Go
本章 目录
下一节
1、中心法则-Central Dogma
Reverse transcription
Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，
生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。
Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原
则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的 RNA的过程。
转录过程的特点
1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有 一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。
反义链 antisense strand（无意义链，负链）：在RNA的转录中， 用作模板的DNA链称为反义链。 有义链 coding strand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不 作为模板的DNA链称为有义链。
Translation 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA
的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。
Reverse translation 逆转录：以RNA为模板，在逆转
录酶的作用下，生成DNA的过程。
本节 目录
2、RNA的生物合成(转录)- Transcription
细胞内RNA的生物功能
(1) 在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。 (2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中， tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的 密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密 码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成 核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。 (3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可 以催化有关的生化反应。 (4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。
Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism
微生物发酵产酶
酶的生产方法
提取分离法 (Extraction)
生物合成 (Biosynthesis)
化学合成 (chemicalsynthesis)
SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea …… organ/tissue/cell