酶工程微生物发酵产酶
酶工程名词解释
12、酶反应器（enzyme reactor）：用于酶催化反应的容器及其附属设备
8、固定化酶（immobilized enzyme）：固定在载体上并在一定的吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面，而使酶固定化的方法，称……
10、包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法
11、必需水：维持分子完整的空间构象所必须的最低水量称……
名词解释：
1。酶工程：酶的生产，改性，与应用的技术过程称为酶工程。主要内容包括：微生物发酵产酶、动植物细胞培养产酶、酶的提取与分离纯化、酶分子修饰、酶，细胞，原生质体固定化、酶非水相催化、酶定向进化、酶反应器和酶的应用等。
主要任务是经过预先设计，通过人工操作活的人们所需要的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中去的过程称为酶的提取。
3、沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从沉淀中析出，与其他溶质分离的技术过程
4、凝胶层析/凝胶过滤/分子排阻层析/分子筛层析等：是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
5、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称……
6、结晶：是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。
7、固定华生物技术（immobilization biotechnoly）；通过物理或化学手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。
酶工程课件
第一节
金属离子置换修饰
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子， 使酶的催化特性发生改变的修饰方法 • 通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的 作用，阐明催化机制
• 适用对象：金属酶（metalloenzyme） – 一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子 作为 辅因子 – 金属离子或是直接参与催化作用，或是对保 持酶的活性和构象起稳定作用 – 金属酶纯化时仍保留着定量 的功能金属离子
10 ~ 13
多层 肽聚糖 (5% ~ 10%) 脂蛋白 脂多糖 磷脂 蛋白质
同 G+
100 ~ 300
多层 葡聚糖(30% ~ 40%) 甘露聚糖(30%) 几丁质(1% ~ 2%) 蛋白质(6% ~ 8%) 脂类(8.5% ~ 13.5%)
100 ~ 250
多层 多聚糖 (80% ~ 90%) 脂类 蛋白质
进行生产的动物细胞培养方式
• 悬浮培养
– 瘤细胞、淋巴细胞
• 贴壁培养
– 滚瓶培养、玻璃瓶、 – 塑料瓶
• 微载体培养
– 葡萄糖凝胶
• 固定化细胞培养
.植物组织培养的条件
.概念
贴壁培养
• 贴壁培养的优点：容易更换培养 液；细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直 接加入新培养液。容易采用灌注 培养，从而达到提高细胞密度的 目的；因细胞固定表面，不需过 滤系统。 当细胞贴壁于生长基质 时，很多细胞将更有效的表达一 种产品。同一设备可采用不同的 培养液/细胞的比例。适用于所有 类型细胞。 • 3.贴壁培养的缺点：与悬浮培养 法相比扩大培养比较困难，投资 大；占地面积大；不能有效监测 细胞的生长；
50
50 40 30 20
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
酶工程
第一章绪论酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程。
酶的生产(enzyme production):通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。
酶的改性(enzyme improving ):通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。
酶的应用(enzyme application):通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。
酶工程的主要内容包括微生物细胞发酵产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞和原生质体固定化，酶的非水相催化，酶反应器和酶的应用等。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的酶；并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。
酶是一类具有催化功能的生物大分子，亦称生物催化剂。
酶的分类：1、氧化还原酶（oxidoreductase）2、转移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、异构酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）酶的催化特性：高效性、高度专一性、反应条件温和且活力可调节影响酶催化反应速率的因素：底物浓度的影响，酶浓度的影响，pH、温度的影响，抑制剂的影响，激活剂的影响米氏方程式：[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度V max：最大反应速度(maximum velocity)Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)米氏常数Km的意义：☐重要特征物理常数，与酶浓度无关。
不同的酶具有不同K m值☐物理意义：Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
☐Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
☐K m值近似等于[ES]的解离常数，可表示酶与底物之间的亲和力：K m值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; K m值小表示亲和程度大,酶的催化活性高☐从k m可判断酶的专一性和天然底物。
第二章 (酶工程)微生物发酵产酶ppt课件
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先 利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生 了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次 生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
腺苷酸 环化酶 cAMP
抑制
CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）
5'-AMP
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
C R P c A M P 复 合 物
C R P + c A M P
cAMP-CRP复合物的作用示意图
操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基 顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因（Structural gene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为 mRNA，再翻译为蛋白质。
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合 而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
酶工程2-2 常用的产酶微生物
3. 红曲霉(Monascus)
• 红曲霉: 菌落初期白色, 老熟后变为淡粉色、紫 红色或灰黑色,通常形成红色色素。菌丝具有隔膜, 多核, 分支甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分支 的顶端, 单生或成链, 闭囊壳球形, 有柄, 其内 散生10 多个子囊, 子囊球形, 内含8 个子囊孢子, 成熟后子囊壁解体, 孢子则留在闭囊壳内。
细 菌
1. 大肠杆菌( Escherichia coli)
• 形态：呈杆状, 有的近似球状, 大小为0. 5μm ×1～3 μm , 一般无荚膜, 无芽孢, 运动或不运动, 运动者周生鞭毛。菌 落从白色到黄白色, 光滑闪光, 扩展。
• 革兰氏染色阴性。 • 产生的酶一般都属于胞内酶, 需要经过细胞破碎才能分离 得到。 • 采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、D N A 聚合酶、 D N A 连接酶、核酸外切酶等, 在基因工程等方面广泛应 用。
• 枯草杆菌是应用最广泛的产酶微生物, 可以用于生产α-淀 粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5′-核苷酸酶和碱性磷酸酶 等。 例如,枯草杆菌BF7658 是国内用于生产α-淀粉酶的 主要菌株;枯草杆菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸 酶。 • 枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶, 而其产 生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。
霉 菌
1. 黑曲霉( Aspergillus niger)
• 是曲霉属黑曲霉群霉菌。
• 菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成, 菌丛黑褐色, 顶囊大球形, 小梗双层, 分生孢子球形, 平滑或 粗糙。 • 黑曲酶可用于生产多种酶, 有胞外酶也有胞内酶。 例如, 糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪 酶、纤维素酶、橙皮苷酶和柚苷酶等。
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
酶工程第二章微生物发酵产酶
精品医学ppt
6
精品医学ppt
7
参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
精品医学ppt
22
精品医学ppt
精品医学ppt
10
大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
精品医学ppt
11
大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
精品医学ppt
30
转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一般是酶催化反应的产物或 代谢途径的末端产物
阻遏物 + 阻遏蛋白 O基因
阻遏物
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的模式（重点）
微生物细胞生长曲线（四阶段）
延迟期（调整期） 生长期（对数生长期） 平衡期 衰退期
Cell amount
酶的生物合成模式（四类）
只有 cAMP-CAP 复合物 到达启动基因位点时， RNA 聚合酶才能顺利结合到相应 位点，开始转录。
微生物发酵产酶
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的调节 —— 转录水平
操纵子学说（operon theory）
操纵子 —— 结构基因 + 操纵基因 + 启动基因
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
概述
酶的发酵生产
经预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，获得人 们所需的酶的过程
前提 —— 选育到性能优良的产酶微生物
生产方式
固体培养 —— 霉菌 液体深层发酵 —— 现代发酵工业的主要方式 固定化培养 —— 固定化细胞、固定化原生质体
转录和翻译中的生物调节作用
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的过程
RNA的合成 —— 转录
以DNA为模板，以核苷三磷酸 （dNTP）为底物，在RNA聚 合酶作用下，生成RNA的过程
起始 延伸 终止
转录后修饰：切除非编码区， 碱基修饰，获得成熟的mRNA
适应型酶（adaptive enzyme）
在细胞中含量变化很大，其合成速率受环境因素影响显著
在所有的生物中，转录水平的调节控制（基因的调节控 制）对酶的生物合成至关重要
原核生物中酶生物合成的调节主要发生在转录水平
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的调节 —— 转录水平
诱导型操纵子（inducible operon）
诱导物激发基因大量表达 乳糖操纵子（Lac operon）
阻遏型操纵子（repressible operon）
阻遏物妨碍基因的正常表达 色氨酸操纵子（Trp operon）
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的调节 —— 转录水平
启动基因结合，阻碍RNA的转录 效应物结合阻遏蛋白之后，阻遏蛋白结构改变，不能结合操纵基因，
RNA聚合酶可以结合启动位点，进行转录
Enzyme Engineering
酶生物合成的调节 —— 转录水平
操纵子学说
——启动基因的两个位点 (1) RNA聚合酶结合 位点 (2) cAMP-CAP复合 物结合位点
微生物发酵产酶
酶生物合成的调节 —— 转录水平
A. 无阻遏物
…R P
O
S1 S2
…
调节模式 3：反馈阻遏作用
即产物阻遏，是指酶催化反应 的产物或代谢途径的末端产物
阻遏蛋白
RNA 聚合酶
转录
翻译 酶
使该酶的生物合成受到阻遏的 B. …
阻遏物（repressor）
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
本章主要内容
微生物细胞中酶生物合成的调节 产酶微生物的特点以及酶发酵生产常用的微生物 发酵工艺条件及控制 酶发酵动力学概述 固定化细胞发酵产酶 固定化原生质体发酵产酶
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的基本理论
酶是蛋白质 —— 如何获得蛋白？—— 蛋白生物合成 从基因到蛋白质：遗传信息的传递 —— 中心法则
转录
翻译
复制 DNA
RNA
逆转录
？
Protein 折叠
Active Enzyme
要生物合成一个酶，首先应知道这个酶对应的基因
生成的多肽链必须经过正确的加工修饰，并正确折叠， 才能生成有活性的酶
—— 根据酶产生与细胞生长的关系
同步合成型
延续合成型
中期合成型 滞后合成型
0A
B CD Time
Enzyme Engineering
操纵子学说（operon theory）
与生物合成相关的四个基因
调节基因 (regulator gene) 启动基因 (promoter gene) 操纵基因 (operator gene) 结构基因 (structural gene)
调节的主要原理
调节基因 阻遏蛋白 结合效应物 结构变化 亲和力变化 阻遏蛋白与操纵基因结合，产生空间排斥作用，妨碍RNA聚合酶与
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的过程
肽链的合成 —— 翻译
以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、 酶和辅助因子，合成多肽链的过程
氨基酸活化生成氨酰-tRNA 肽链合成起始
Enzyme Engineering
酶生物合成的过程
调节模式 1：分解代谢物阻遏作用
某些物质（容易利用的碳源）经过分解代谢产生的物质阻遏了某 些诱导酶生物合成的现象
连锁效应
实质 —— cAMP 通过启动基因调控酶的合成 解决 —— 添加 cAMP，控制易用碳源的用量
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的调节 —— 转录水平
肽链的合成 —— 翻译
肽链延伸 肽链合成的终止 肽链翻译后加工
Met/fMet切除 —S—S— 肽链折叠 ……
微生物发酵产酶
Enzyme Engineering
微生物发酵产酶
酶生物合成的调节
组成型酶（constitutive enzyme）
在细胞中的量比较恒定，环境因素对这类酶的合成速率影响不大
A. 无诱导物
…R P
O
S1 S2
…
调节模式 2：诱导作用
加入某些物质（诱导物） 阻遏蛋白
使酶的生物合成开始或加 B. 添加诱导物
速进行的现象
…R P
O
S1
S2
…
诱导物（inducer）
RNA聚合酶
酶催化作用的底物或其 诱导物 底物类似物
×
转录
翻译
酶
Enzyme Engineering