微生物发酵产酶
第二章 微生物发酵产酶
曲霉、欧文氏菌 啤酒酵母、假丝酵母
水勇果于加工开，始果，汁、才果能酒找澄到清，成麻类纤维脱胶
功的路
制造转化糖
凝乳酶
米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶 制造乳酪
脂肪酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶
曲霉、根霉、酵母等 青霉、曲霉 凝结芽胞杆菌，白色链霉菌 细菌、霉菌、放线菌
加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工 食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖 生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸
第三节 发酵工艺条件及控制
工艺流程
原生质体 固定化原生质体
培养基
保藏细胞 细胞活化 扩大培养
发酵 分离纯化
酶
固定化细胞
预培养 无菌空气
一、细胞活化与扩大培养
1、生产菌种的来源
（1）购买或筛选
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）
一、产酶菌种的要求
1、发酵周期短，产量高； 2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、利于酶的分离纯化； 5、安全可靠，无毒性。（非致病菌）。
二、产酶微生物
菌种是发酵生产酶的重要条件。已经在自然界中 发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有 50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放 线菌、酵母菌、霉菌。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶
α-淀粉酶
葡萄糖淀粉酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶
植酸酶
产酶微生物 枯草芽胞杆菌， 地衣芽胞 杆菌， 米曲霉
米曲霉，黑曲霉，米根霉 枯草芽胞杆菌，米曲霉
地衣芽胞杆菌 黑曲霉，毕赤酵母工程菌株
文档：酶的制备
酶的制备酶的制备主要有两种方法，即直接提取法和微生物发酵生产法。
早期酶制剂是以动植物作为原料，从中直接提取的。
由于动植物生长周期长，又受地理、气候和季节等因素的影响，因此原料的来源受到限制，不适于大规模的工业生产。
目前，人们正越来越多地转向以微生物作为酶制备的主要来源。
—、酶的微生物发酵生产法1.微生物发酵生产法的优点酶的品种齐全微生物种类繁多，目前已鉴定的微生物约有20万种，几乎自然界中存在的所有的酶，我们都可以在微生物中找到。
酶的产量高微生物生长繁殖快，生活周期短，因而酶的产量高。
许多细菌在合适条件下20min左右就可繁殖一代，为大量制备酶制剂提供了极大的便利。
生产成本低培养微生物的原料，大部分比较廉价，与从动、医学教育|网搜集整理植物体内制备酶相比要经济得多。
便于提高酶制品获得率由于微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱变等方法培育出高产量的菌种。
另外，结合基因工程、细胞融合等现代化的生物技术手段，可以完全按照人类的需要使微生物产生出目的酶。
正是由于微生物发酵生产具有这些独特的优点，因此目前工业上得到的酶，绝大多数来自于微生物，如淀粉酶类的α一淀粉酶、β一淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及异淀粉酶等都是从微生物中生产的。
2.微生物发酵生产法中尚待解决的问题尽管微生物发酵法生产酶制剂存在上述优点，但仍存在一些问题需要解决。
消除毒性微生物发酵法生产的酶制品中会带人一些细菌自身的生理活性物质，这些生理活性物质往往对人体有害，因此进行毒性实验是必需的。
优良产酶菌种的筛选、培育目前，大多数工业微生物制酶生产采用的菌种较少，仅局限于11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。
只有不断寻找更多的适用的产酶菌种，才可能使越来越多的酶采用微生物发酵法进行工业化生产。
3.微生物发酵生产法的条件控制微生物酶的发酵生产是在人为控制的条件下有目的迸行的，因此条件控制是决定酶制剂质量好坏的关键因素。
条件控制包括以下几个方面。
第二章 (酶工程)微生物发酵产酶ppt课件
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先 利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生 了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次 生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
腺苷酸 环化酶 cAMP
抑制
CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）
5'-AMP
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
C R P c A M P 复 合 物
C R P + c A M P
cAMP-CRP复合物的作用示意图
操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基 顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因（Structural gene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为 mRNA，再翻译为蛋白质。
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合 而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
酶工程第二章微生物发酵产酶
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参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
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大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
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大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
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转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
微生物与食品发酵
微生物与食品发酵微生物是一类非常微小的生物体，包括细菌、真菌和酵母等。
在食品加工和制作过程中，微生物起着至关重要的作用，特别是在食品发酵中。
食品发酵是利用微生物的代谢反应来改善食品的品质、味道和保存性的过程。
一、微生物对食品发酵的作用1. 产生酶：微生物可以产生各种酶，例如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等。
这些酶可以分解食材中的复杂物质，将其转化为更简单的物质，方便人体吸收和消化。
2. 发酵代谢：微生物通过发酵代谢来改变食材的性质。
比如，乳酸菌发酵牛奶会产生乳酸，使牛奶呈酸性，增加其保鲜期。
另外，酵母菌的发酵可以产生二氧化碳，使面团膨胀发酵，制作出松软的面包。
3. 产生芳香物质：微生物在发酵过程中会产生各种芳香物质，如酮、醇、醛等。
这些化合物可以赋予食品特殊的风味和香气。
4. 抑制食材变质：一些微生物可以产生抑菌物质，抑制其他有害微生物的繁殖，延长食品的保鲜期。
二、常见的发酵食品及其微生物1. 酸奶：酸奶是利用乳酸菌对牛奶发酵制成的。
乳酸菌在发酵过程中将乳糖转化为乳酸，使牛奶变酸。
酸奶富含活性乳酸菌，有助于调节肠道菌群平衡，增强免疫力。
2. 白酒：白酒是利用酒曲中的酵母菌对谷物进行发酵制成的。
酵母菌在发酵过程中将谷物中的淀粉转化为酒精和二氧化碳，形成了酒精，赋予了白酒其特有的香气和味道。
3. 酱油：酱油是利用酱母对大豆和小麦粉进行发酵制成的。
酱母是一种含有多种微生物的发酵剂，包括大豆霉、面霉和酵母等。
在发酵过程中，这些微生物分解大豆中的蛋白质和淀粉，形成酱油中的氨基酸和糖类物质。
4. 咖啡：咖啡是利用咖啡豆发酵制成的。
咖啡豆在采摘后要进行发酵，以去除豆膜和豆浆，使豆子呈现出咖啡的独特风味。
5. 奶酪：奶酪是利用乳酸菌和霉菌对牛奶发酵制成的。
乳酸菌发酵使牛奶变酸，霉菌则负责产生特殊的风味和质地。
三、发酵过程的条件与控制成功的食品发酵过程需要合适的温度、湿度和发酵时间等条件。
1. 温度：不同的微生物对温度有不同的要求。
发酵法生产酶的原理
发酵法生产酶的原理
发酵法生产酶的原理是利用微生物在特定条件下通过发酵过程生产酶。
发酵生产酶的一般步骤如下：
1. 选取适当的微生物：根据所需的酶的类型和性质，选择合适的微生物菌株。
2. 培养微生物种子菌：将选定的微生物菌株接种进含有适宜营养物质和适宜温度、pH值的培养基中，进行预培养。
3. 大规模培养：将预培养的微生物菌液接种进大规模的发酵罐中，提供足够的营养物质和良好的培养条件，如温度、pH值和氧气供应等。
4. 酶的产生和积累：在培养过程中，微生物菌株通过代谢产生有益酶的合成。
合成的酶可被菌体细胞外排出，也可积累在菌体内。
5. 分离和提取酶：发酵结束后，通过离心、过滤或其他分离方法，将菌体与培养液分离。
然后，从菌体或培养液中提取酶。
发酵法生产酶的原理是基于微生物的生物代谢能力。
微生物通过合适的营养物质和培养条件，利用糖类、脂肪和蛋白质等有机物进行代谢，产生酶作为催化剂。
这些酶能够在特定的温度、pH值和底物浓度等条件下，促进生物化学反应的进行，从而转化底物为所需的产物。
微生物发酵产酶
抗体酶 （abzyme）
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
抗体酶制备的理论依据： 1948年， Pauling提出的过渡态理论； 1975年，Kohler和 Milstein发明的单克隆抗体制备技术； 1986年，Lerner和Schultz 分别获得具有催化活性的抗体酶。此 后，不少抗体酶被制备出来。
本章小结
1. 不是所有的微生物都能用于发酵产酶；
2. 微生物生长有4个时期，微生物培养产酶有4种方式，可根据 蛋白质生物合成理论、操纵子理论调节控制；
3. 影响微生物生长的环境因素有：培养基的组成、pH、温度、 溶解氧，精心调节，效益增加；
4. 固定化微生物发酵产酶是在传统方式上的一种新尝试，优点 很多。
一、酶生物合成的模式 二、细胞生长动力学 三、产酶动力学
酶生物合成的模式
细胞生长过程（4个阶段）： 调整期、生长期、平衡期、衰退期。
酶生物合成模式（4种）： P60图2－9 ➢ 同步合成型 ➢ 延续合成型 ➢ 中期合成型 ➢ 滞后合成型 结论：最理想的合成模式是延续合成型。
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶
P53
调节pH值的必要性: 培养基的pH值与细胞的生长、繁殖以及 发酵产酶关系密切。
pH值变化的原因：
细胞的生长和代谢产物的积累；
细胞特性；
培养基的组成成分；
P54
发酵工艺条件。
调节pH值常用的的方法：
改变培养基的组分或其比例； 使用缓冲液； 通过流加适宜的酸、碱溶液到培养 基中。
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产生一种阻遏 决定酶的合成
蛋白，由多个 是否开始，有
亚基组成。 两个位点：一
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组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似
物面临时合成的一类酶。 2.阻遏 (repression)：加进某种物质（代谢物），使酶 生物合成受到阻止。
分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)
酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所 合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。 DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而 合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的 调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因 表达的调控主要在转录水平上进行。
酶合成调节的类型
四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。其中： 一个起始密码: AUG 三个终止密码: UAA UGA UAG 多数氨基酸拥有 2-4个密码
蛋白质合成的几个要素- 转运RNA (transporter)
tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。 tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异 结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因 的结合力。
2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是 以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物 中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由 1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物 中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶 Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目 为4～10个，亚基种类有4～6种。
本节 目录
4、酶生物合成的调节 (regulation)
定义：通过调节酶合成的量来控制（微）生物代谢 速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。
意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原 料和能量。 基因水平的表达控制 酶含量的调节 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同 一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。
转录过程
起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸 elongation 转录终止 termination 转录后加工 modification
Enzyme assembly,
promoter recognition, activator binding
Contents of chapter 2
Go 1、酶生物合成过程 Go 2、常见产酶微生物 Go 3、酶的发酵工艺条件及控制 Go 4、酶生产过程的动力学
2.1 酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme
Go 1、中心法则- Central Dogma Go 2、RNA的生物合成- Transcription Go 3、蛋白质的生物合成- Translation Go 4、酶生物合成的调节- Regulation
基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）
操纵子——基因表达的协同单位
操纵子
结构基因（编码蛋白质, structural gene, S）
控制部位
操纵基因（operator gene, O） 启动子（promotor gene, P）
例如：乳糖操纵子的结构
2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的 活性降低，直至消失。
3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长 的经济原则：不需要就不合成。
某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编 码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。 能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止 合成的酶叫阻遏酶。
二十世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些 酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶
酶合成诱导的现象—Jacob and Monod的工作： 已知分解利用乳糖的酶有：b-半乳糖苷酶； b-半乳糖苷透过酶；
硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：
1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； 2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种 酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失； 3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。
The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell
蛋白质合成的几个要素-其他因子和酶
其他辅助因子 工具酶
蛋白质的合成过程
肽链合成的起始 initiation 肽链合成的延伸 elongation 肽链合成的终止与释放 termination and release 合成多肽的输送和加工 transport and modification 蛋白质分子的折叠 folding
均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互 补结合。
酪
5’ 酪氨酰- tRNA
AUG
反密码
GUU UAC ACA
5’
3’ mRNA
密码(codon)与反密码(anticodon) 的碱基配对
蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome
核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是 存在于细胞质内的微小颗粒。
本节 目录
3、蛋白质的合成(翻译)-Translation
翻译: 以RNA中mRNA为模板,按照其 核苷酸顺序所组成的密码指 导蛋白质的合成的过程.
翻译
mRNA
蛋白质
各种信息
各种蛋白质
（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）
蛋白质合成的几个要素-mRNA(模板，template)
mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。
Possible catalytic subunits
36.5 kDa
Role unknown (not needed in vitro)
151 155 11 kDa
Promoter specificity
(32-90 kDa)
The E. coli RNA polymerase holoenzyme consists of six subunits: a2bb’ s.
反应式
AA + tRNA + ATP
氨酰-tRNA合成酶
氨酰-tRNA +AMP + PPi
对于E.coli等原核生物
而言，肽链合成时的第一个 氨基酸都是甲酰甲硫氨酸 （fMet）。
氨基酸活化生 成氨酰-tRNA
蛋白质合成起始
原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP和起始因子 （Initiation Factor）的参与下，核糖体30S亚基， fMet-tRNA，mRNA和50S亚基结合，组成起始复 合物的过程。主要包括5个步骤：
Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism
微生物发酵产酶
酶的生产方法
提取分离法 (Extraction)
生物合成 (Biosynthesis)
化学合成 (chemicalsynthesis)
SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea …… organ/tissue/cell
(3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可 以催化有关的生化反应。
(4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。
转录过程的特点
1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有 一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。
反义链 antisense strand（无意义链，负链）：在RNA的转录中， 用作模板的DNA链称为反义链。 有义链 coding strand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不 作为模板的DNA链称为有义链。
某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码 的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。能诱 导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶。
酶合成阻遏的现象—Jacob and Monod的工作： 实验：
1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内 有色氨酸合成酶的存在；
细胞内酶的调控模式
底物水平B
酶活性的调节 酶含量的调节 酶的定位调节
的调节
X 辅助因 子调节
产物调节
生长发育的不同时期 外界环境变化 酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）
酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞 根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量， 从而对各种生物化学过程进行调控。
Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus …… Plant cell culture Animal cell culture
Few example
Translation 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA
的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。
Reverse translation 逆转录：以RNA为模板，在逆转
录酶的作用下，生成DNA的过程。
本节 目录
2、RNA的生物合成(转录)- Transcription
细胞内RNA的生物功能