华中科技大学发酵工程 第二章 工业用微生物菌种
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发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
分离与筛选菌种的基本步骤
样品采集 富集 培养 筛选
产物分析
调查研究（包括资料查阅）
筛
试验方案设计
选
采样
工
增殖条件探索
第一次增殖培养
作
第一次平板分离
程
第二次增殖培养
第一次原种斜面 序
根据实际情况进 行定量或半定量 测定
第二次平板分离 第二次原种斜面
定量或半定量测定
初筛（1株1瓶）
第三次平板分离
第三次原种斜面
4、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyleum)
➢ 芽孢卵形，中生或次端 生，使芽孢囊膨大成梭状 或鼓槌形; ➢ 专性厌氧; ➢ 发酵生产丙酮丁醇.
5、肠膜状明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)
➢可生产葡聚糖; ➢使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
（五）其它微生物
1、噬菌体 寄生在原核生物中的病毒，对发酵工业的生产
第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT
筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
2019
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(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
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连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
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比生长速率u
A B
r
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基质浓度
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限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
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2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
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3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
发酵工程第二章发酵工业菌种
力较高的菌株。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
➢ 例如，青霉素的发酵生产，在投产之初只有 40U·mL-1，得到黄色晶体，青霉素纯度很低，价 比黄金；而现在采用新型菌种可以达到 60000U·mL-1以上，得到晶体为纯白色，青霉素纯 度高达95%以上，成本不到0.1元。
➢ 青霉素发酵生产的这种质的飞跃，生产所用菌种 在其中起了关键作用。
菌种选育有何意义？
1
建筑精选课件
本章内容
一、常用发酵工业菌种
二、发酵工业菌种的分离筛选
三、发酵工业菌种鉴定
四、发酵工业菌种改良
四、发酵工业菌种保藏
2
建筑精选课件
第一节 常用发酵工业菌种
3
建筑精选课件
➢ 工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵 工艺和后提取工艺三个因素，其中拥有良好生产 菌种是前提，菌种质量好坏直接影响了发酵产品 的产量、质量及其成本。
4
建筑精选课件
微生物菌种是决定发酵产品的工业化价值以及 发酵过程成败的关键，只有具备良好的菌种基 础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想 的发酵产品。
优良菌种都是通过菌种选育获得的。 菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、
杂交育种和基因工程育种。
5
建筑精选课件
菌种选育的意义：
➢ 提供产量 ➢ 提高产品质量 ➢ 改善加工工艺和开发新产品。 ➢ 在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种
在发酵工业上，经常利用酵母的代谢进行啤酒、
白酒、黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及
生产乙醇、甘油、有机酸及麦角固醇等多种产
品。
15
建筑精选课件
霉菌
– 曲霉属 米曲霉 黑曲霉
– 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
➢ 例如，青霉素的发酵生产，在投产之初只有 40U·mL-1，得到黄色晶体，青霉素纯度很低，价 比黄金；而现在采用新型菌种可以达到 60000U·mL-1以上，得到晶体为纯白色，青霉素纯 度高达95%以上，成本不到0.1元。
➢ 青霉素发酵生产的这种质的飞跃，生产所用菌种 在其中起了关键作用。
菌种选育有何意义？
1
建筑精选课件
本章内容
一、常用发酵工业菌种
二、发酵工业菌种的分离筛选
三、发酵工业菌种鉴定
四、发酵工业菌种改良
四、发酵工业菌种保藏
2
建筑精选课件
第一节 常用发酵工业菌种
3
建筑精选课件
➢ 工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵 工艺和后提取工艺三个因素，其中拥有良好生产 菌种是前提，菌种质量好坏直接影响了发酵产品 的产量、质量及其成本。
4
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微生物菌种是决定发酵产品的工业化价值以及 发酵过程成败的关键，只有具备良好的菌种基 础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想 的发酵产品。
优良菌种都是通过菌种选育获得的。 菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、
杂交育种和基因工程育种。
5
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菌种选育的意义：
➢ 提供产量 ➢ 提高产品质量 ➢ 改善加工工艺和开发新产品。 ➢ 在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种
在发酵工业上，经常利用酵母的代谢进行啤酒、
白酒、黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及
生产乙醇、甘油、有机酸及麦角固醇等多种产
品。
15
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霉菌
– 曲霉属 米曲霉 黑曲霉
– 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
发酵工程 (第2章)
（b）营养缺陷型的意义 在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产 物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服 生长障碍，就能使中间产物积累。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，在杂 交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，可以 作为基因工程中的受体菌，检出克隆基因的表达。
（二）微生物菌种的选育
1、自然选育 不经过人工处理，利用微生物自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育。 自然选育简单易行，可以达到纯化菌种，防 止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。 自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液， 用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测 定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。
（2）抗肿瘤药物产生菌的分离。 原理一（p21）： 临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或 抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核 酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以大 部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利 用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。 <1> 生化诱导分析法（BIA） <2> SOS显色法
c 、不形成孢子只通过芽殖的“假酵母”属半知菌。
工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等
4、霉菌（mould）
霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养 基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统 称霉菌。 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉 子囊菌纲：红曲霉 半知菌类：曲霉，青霉。
所有菌都长
完全培养基上 长成单孢菌落 基本培养基 完全培养基 轻压在绒布上 无菌丝绒布 橡皮箍 接上所有菌落的绒布 转印在新鲜 的培养基上
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提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品
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发酵工业菌种改良方法
常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
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菌种选育改良的具体目标
/jpkc
细菌分离：以乳酸菌为例
取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中
加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h
培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌
用选择性培养基分批富集培养2-3代
稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落
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最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
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未培养微生 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 宏基因组分析法
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二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 （一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
/jpkc
/jpkc
本章内容
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
/jpkc
对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容； 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才
/jpkc
设计筛选方案时必须考虑两个要点
▪ 选择性 ▪ 灵敏度
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3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微
生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株
寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。
➢ 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速
灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
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药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
/jpkc
▪ 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
/jpkc
试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后
产氨基酸菌落周围有生长圈
对应到copy前相应
位置，找到目的菌落
目的菌落进行液体培养，
对产物进行定量测定
筛选产物含量高的菌株
多糖产生菌的筛选
取样特点：碳水化合物工业的废弃物 筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液
状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
/jpkc
连续富集培养技术分离菌株的优点
分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
/jpkc
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特 生长特征独特
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
/jpkc
选择性分离原理和技术
Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种
/jpkc
赖氨酸生产菌种的选育改良思路
出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
/jpkc
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
/jpkc
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
/jpkc
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
/jpkc
2. 菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； 培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
/jpkc
抗生素产生菌的筛选
筛选模型：试验菌
筛选方法：
▪ 固体培养筛选
铺菌法 复印平板法
▪ 液体培养筛选
/jpkc
2. 菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
/jpkc
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
▪ 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
/jpkc
A
μ
B
S0 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛选模型：形态依据
斜面保藏 高产菌恢复 放大培养，发酵液性能测试
/jpkc
真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
/jpkc
含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
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氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）
乳酸生成量测定（滴定法）
Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）
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放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
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样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法
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发酵工业菌种改良方法
常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
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菌种选育改良的具体目标
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细菌分离：以乳酸菌为例
取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中
加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h
培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌
用选择性培养基分批富集培养2-3代
稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落
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最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
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未培养微生 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 宏基因组分析法
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二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 （一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
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本章内容
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
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对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容； 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才
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设计筛选方案时必须考虑两个要点
▪ 选择性 ▪ 灵敏度
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3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微
生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株
寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。
➢ 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速
灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
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药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
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▪ 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
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试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后
产氨基酸菌落周围有生长圈
对应到copy前相应
位置，找到目的菌落
目的菌落进行液体培养，
对产物进行定量测定
筛选产物含量高的菌株
多糖产生菌的筛选
取样特点：碳水化合物工业的废弃物 筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液
状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
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连续富集培养技术分离菌株的优点
分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
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分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特 生长特征独特
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
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选择性分离原理和技术
Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种
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赖氨酸生产菌种的选育改良思路
出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
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高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
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1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
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2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
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2. 菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； 培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
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抗生素产生菌的筛选
筛选模型：试验菌
筛选方法：
▪ 固体培养筛选
铺菌法 复印平板法
▪ 液体培养筛选
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2. 菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
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（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
▪ 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
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A
μ
B
S0 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛选模型：形态依据
斜面保藏 高产菌恢复 放大培养，发酵液性能测试
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真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
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含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
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氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）
乳酸生成量测定（滴定法）
Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）
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放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
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样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法