蛋白质与酶工程复习资料

第一章1、蛋白质工程的产生：1，最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982-1985年间对酪氨酰-t-RNA合成酶的分子改造工作。

2，佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。

3，1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。

二，蛋白质工程的内容1、定义：广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。

2、内容：确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。

根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质三，蛋白质工程的程序蛋白质分子设计基因改造方案基因成或突变分离纯化蛋白质结构蛋白质分子基因克隆与表达目的基因和功能测定改造的蛋白质分子四，酶工程的应用范围（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。

其中固定化酶技术是酶工程的核心。

实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。

五，医用药物酶应用的问题：1）异体蛋白引起免疫反应；2）酶不纯，引起各种副作3）酶在体内降解，时间短； 4）药物无法定向分布。

解决办法： 1) 制成微胶囊； 2) 制成衍生物；3) 制成脂质体包埋与免疫系统隔开(酶蛋白)；4) 酶上引入一定基团，起导向作用。

五，分子酶学与酶工程1、酶——由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或其它类型的生物大分子），是生物体进行代谢、维持生命活动的必需物质，没有酶就没有生命，因此研究酶的结构与功能、性质与作用机理，对于阐明生命现象的本质具有重要意义。

2、分子酶学——在分子水平上探讨酶与生命活动的关系，研究酶与代谢调节、酶与疾病、酶与生长发育等酶学问题。

第二章一，构型与构象是描述分子的两种不同空间异构现象1，构型是一个分子中原子的特定空间排布，当一种构型改变为另一种构型时必须有共价键的断裂和重新形成。

L型和D型。

2，构象组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。

构象转变不要求有共价键的断裂和重新形成。

二，多肽链β层的特点和分类分类：1．β链；2．平行β层和反平行β层；3．混合型β层和扭转β层。

β－层结构特点是： ①是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。

氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。

②依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C＝O与H原子形成氢键，使构象稳定。

③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。

即前者两条链从“N 端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。

β－片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。

④平行的β－片层结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的β－片层结构，则间距为0.7nm。

三，蛋白质的二级结构概念：在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，可以用相同的构象角(Φ，Ψ)来表征，构成一种特征的多肽链线性组合，称为蛋白质的二级结构。

二级结构是多肽主链局部区域的规则结构，它不涉及侧链的构象和与多肽链其他部分的关系。

二级结构主要包括：α螺旋、平行β层、反平行β层，β转折、310螺旋。

二级结构的规则构象主要被其内部形成的主链氢键所稳定，因此氢键的排布方式也是二级结构的重要特征。

四，结构模体概念：在蛋白质中常常发现，一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中也靠近，彼此按特定的几何排布形成简单地组合，可以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合单位称为结构模体。

特征：结构模体是一类超二级结构(supersecondary structure)．它们是三级结构的建筑模块。

有的模体与特定的功能相关，如与DNA结合；许多模体并没有专一的生物功能，只是大结构和组装体的一个组成部分。

五，结构域概念： 二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中 形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域(domain)。

特征：结构域是蛋白质三级结构的基本单位，它可由一条多肽链(在单域蛋白质中)或多肽链的一部分(在多域蛋白质中)独立折叠形成稳定的三级结构。

一个分子中的结构域区之间以共价键相连接，这是与蛋白质亚基结构(非共价缔合)的基本区别。

一般说来，较大的蛋白质都有多个域区存在，它们可以非常不同的方式组合，从而以有限类型的域区结构组合成极为复杂多样的蛋白质整体结构。

正是在结构域的基础上，才有可能对蛋白质进行结构分类。

同时，结构域也是功能单位，不同的结构域常常与蛋白质的不同功能相关联。

六，蛋白质按结构域分类(1) α型结构(αstructure)(2) β型结构(β structure)(3) α/β型结构(4) α+β型结构(5) 无规型／富含二硫键和金属离子型(1)α型结构这类蛋白质主要由α螺旋组成，其螺旋含量一般在60％以上，有的高达80％。

α螺旋在这类蛋白质中大多以反平行方式排布和堆积，所以又称反平行α结构。

按照螺旋排布的不同拓扑学特征，又可分为一些亚组。

肌红蛋白、血红蛋白、烟草花叶外壳蛋白、细胞色素b，等均属此类结构。

分类：线绕式α螺旋；四螺旋束；珠状折叠；复杂螺旋组合。

(2)β型结构此类结构主要由反平行β层构成。

β型结构在大小和组织上都有很大的变异范围，但在大多数情况下反平行β层都缠绕成一柱状或圆桶状，其缠绕方式可以是链间的顺序连接，也可以是链间的跨接。

丝氨酸属水解酶、免疫球蛋白A、一些球状RNA病毒的外壳蛋白等均属此类。

分类：根据其形貌和组织特征可概分为：上一下桶式和开放式折叠；希腊钥匙(回纹)式折叠；β螺旋折叠。

(3) α/β型结构这是已知数量最多的一类结构，它由平行的或混合型的β层被α螺旋包绕构成，主要是β-α-β模体的组合。

在这类结构中β层和螺旋内部各股链主要以平行方式排布，所以也称为平行α/β型。

当然，其中螺旋与相邻β链彼此是反平行的。

多数情况下，一个5～9条链组成的平行β层在中央，两侧是α螺旋，形成三层式结构。

依据β链组织方式的不同，它们呈现出许多不同类型。

丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、磷酸甘油酸激酶等均属此类结构。

3种基本类型：TIM桶式折叠；扭转开放式折叠；马蹄式折叠。

(4)α+β型结构这类结构中既含α螺旋又含β层结构，但α螺旋与β层在空间上彼此不混杂，分别处于分子的不同部位，有时α螺旋和β层分别形成两个结构域。

已知这类结构的数量不多，因此有时将它们按α螺旋或β层部分的组织特征分别划入以上三种类型中。

溶菌酶、嗜热菌蛋白酶、核酸酶等属此类结构。

(5)无规型／富含二硫键和金属离子型这是一类小蛋白质分子，它们没有典型的二级结构，或者所含二级结构的组成和组织没有明显的规律可循。

这类蛋白质分子虽然不大(一般小于100个氨基酸残基)，但含有较多的二硫键或金属离子以稳定其三维结构，所以在有的分类中称它们为富含二硫键和金属离子型蛋白第三章一，蛋白质设计的目的1，为蛋白质工程提供指导性信息。

2，探索蛋白质的折叠机制。

二，蛋白质分子设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。

蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。

三，蛋白质设计原理①内核假设。

所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。

在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。

②所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。

（2个因素）③所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)。

四，蛋白质的定位突变种类1，插入一个或多个氨基酸残基；2，删除一个或多个氨基酸残基；3，替换或取代一个或多个氨基酸残基。

4，最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法。

五，蛋白质设计的目标及解决办法六，蛋白质分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（de novo protein design）。

第四章一，大肠杆菌中表达体系的优点大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。

利用大肠杆菌作为表达体系的优点：1）遗传学和生理学背景清楚；2）容易培养，特别是高密度发酵；3）外源基因经常可以达到高效表达。

大肠杆菌表达体系的缺点（大肠杆菌系统最大的不足之处是）（1）不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；（2）广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。

（3）外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；（4）而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。

最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，（5）有时不能得到足够的产物。

二，哺乳动物细胞表达体系的优点1，哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。

2，哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。

它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。

哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。

实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。

在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。

三，泌型哺乳动物细胞表达系统1，哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。

2，这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用使起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。

3，从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。

4，分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。

第五章一，微生物的生长的规律将少量的某细菌接种的恒定容积的液体培养基中，并置于适宜的环境中，定期取样，测定微生物群体生长的规律。

微生物的生长曲线分为迟缓期、对数期、稳定期和死亡期四个主1.迟缓期：（1）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。

（2）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶。