光激化学发光技术介绍 ppt课件
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光激化学发光技术.pptx
光激化学发光分析技术
光激化学发光（LICA） 新一代化学发光技术
Light Initiated Chemiluminescent Assay
• 以纳米微粒为基础 • 无需固相分离
• 均相化学发光免疫技术
感光微球
发光微球
发光免疫分析 广泛应用于临床定量检测中
时
间
发
荧
分
光
光
酶
辨
直
电
氧
偏
促
荧
接
化
通
振
化
感光 微粒
激光照射 （680nm）
200nm
发光
微粒 发光
（615nm）
结合即发光 不结合不发光
光激化学发光（LICA）
反应原理 • 感光微球
➢ 覆盖感光物质酞箐，包被链霉亲和素
➢ 接受激光照射（680nm），生成高能单线态氧
塑料-活化基团
酞箐（鲁米诺类化学发光物质）
1O2
激光照射（680nm）
酞箐
光
化
学
道
免
学
免
学
发
免
疫
发
疫
发
光
疫
分
光
分
光
试
析
析
验
20世纪60年代 1977
1982
1983
1990
1993
光激化学发光（LICA） 集多种技术的优秀性能为一体
• 独特信号产生方式（能量转移） 双标记 免分离 荧光素（Eu）
• 纳米固相材料（悬浮性能-动力学-三维立体） • 生物素-亲和素系统（放大效应）
高能单线态氧的产生和传递
1O2
• 1O2 生存时间4微秒
光激化学发光（LICA） 新一代化学发光技术
Light Initiated Chemiluminescent Assay
• 以纳米微粒为基础 • 无需固相分离
• 均相化学发光免疫技术
感光微球
发光微球
发光免疫分析 广泛应用于临床定量检测中
时
间
发
荧
分
光
光
酶
辨
直
电
氧
偏
促
荧
接
化
通
振
化
感光 微粒
激光照射 （680nm）
200nm
发光
微粒 发光
（615nm）
结合即发光 不结合不发光
光激化学发光（LICA）
反应原理 • 感光微球
➢ 覆盖感光物质酞箐，包被链霉亲和素
➢ 接受激光照射（680nm），生成高能单线态氧
塑料-活化基团
酞箐（鲁米诺类化学发光物质）
1O2
激光照射（680nm）
酞箐
光
化
学
道
免
学
免
学
发
免
疫
发
疫
发
光
疫
分
光
分
光
试
析
析
验
20世纪60年代 1977
1982
1983
1990
1993
光激化学发光（LICA） 集多种技术的优秀性能为一体
• 独特信号产生方式（能量转移） 双标记 免分离 荧光素（Eu）
• 纳米固相材料（悬浮性能-动力学-三维立体） • 生物素-亲和素系统（放大效应）
高能单线态氧的产生和传递
1O2
• 1O2 生存时间4微秒
化学发光原理及应用ppt课件
Part III. 化学发光法的临床应用
甲状腺功能的免疫分析 糖代谢紊乱的免疫分析 常见肿瘤标志物及其免疫分析 常见传染性疾病的免疫检测
– – –
病毒性肝炎 HIV感染 严重急性呼吸综合征（SARS)
其他免疫检测项目
甲状腺功能的免疫分析
• 甲状腺机能的常见评价指标及其临床
意义 1.甲状腺机能亢进 2.甲状腺功能减退 3.低T3和低T3、T4综合征
C肽
C肽测定用于了解II型糖尿病人是否需要胰岛素治疗，如 果C肽水平较低，葡萄糖刺激反应差，则表示表明立即或 最终需要胰岛素治疗，也可用于评价糖尿病酮症酸中毒病 人的胰岛功能。C肽的另一个重要的临床用途是各种低血 糖病因的鉴别。C肽水平升高科见于轻型糖尿病患者，常 见空腹血糖升高不多者C肽大多高于正常。胰岛素瘤患者， 如血中存在胰岛素抗体，血清C肽大都增高。胰腺肿瘤患 者行胰腺切除后，如血清C肽仍可测出，提示手术未能全 部切除胰腺组织。如果手术后一度阴性，后又称为阳性， 提示肿瘤复发或转移。 在肝硬化时，血浆胰岛素有升高趋势，其原因在于肝脏摄 取和降解胰岛素减少；但空腹血糖正常。
癌胚铁蛋白 糖蛋白 肝 癌胚抗原 糖蛋白 结肠、直肠、胰 腺、肺、乳腺
胰癌胚抗原 糖蛋白 胰腺
鳞状细胞抗 糖蛋白 肺、皮肤、头和 原 颈部
组织多肽抗 细胞角 乳腺、结肠 原 蛋白
CEA
• 原发性结肠癌，患者CEA升高者占45-90%. • 胰腺癌、胆管癌、胃癌、食道癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系 •
三、低T3和低T3、T4综合征
• 低T3综合征是一种由于非甲状腺疾病 造成的甲状
腺激素异常，其发生与机体的代谢状态，基础疾 病的性质和严重程度以及外来因素，如用药等有 关。代谢状态差、基础病情加重时其发生率随之 增高；当病情好转、机体健康状况趋于正常时， 低T3状态可自行消失。
化学发光介绍-PPT
26
肿瘤标志物
组织多肽抗原（TPA） 临床意义：主要见于恶性肿瘤；也可见于急性肝炎、胰腺炎、肝 炎等，但增高程度较轻。 前列腺特异性抗原（PSA） 临床意义：主要见于前列腺癌，是前列腺癌首选和最有应用价值 的肿瘤标志物。前列腺增生、前列腺炎、良性前列腺瘤、肾脏和泌 尿生殖系统疾病时，PSA可轻度升高
乙肝五项标志物的检测 3、HBeAg和HBeAb（HBeAg作为乙肝病毒复制增殖的间接指标） HBeAg阳性：说明病毒复制活跃，传染性强，是乙肝患者具有传
染性指标。可见于急、慢性乙肝和乙肝病毒携带者，如持续阳性， 表明乙肝转为慢性迁延性肝炎 HBeAb 在急性肝炎时，此抗体阳性表明乙肝复制缓解或终止，在慢性肝 炎或肝硬化患者，此抗体阳性说明乙肝病毒DNA与肝细胞发生整 合，提示病情较长，预后不佳。
27
肿瘤标志物
游离前列腺特异抗原（F-PSA）与F-PSA/PSA比值 临床意义：F-PSA 见于前列腺增生和前列腺癌，但前列腺癌增高 程度不如前列腺增生明显。 F-PSA/PSA降低 见于前列腺癌和前列腺增生，但前列腺癌的降低 程度明显高于前列腺增生 前列腺酸性磷酸酶（PAP） 临床意义：见于前列腺癌、前列腺增生，但前列腺癌增高更明显
22
肿瘤标志物
甲胎蛋白（AFP）
临床意义：常见于原发性肝炎、大多数卵巢和睾丸胚胎性肿瘤或 畸胎瘤，生殖腺外生殖细胞瘤，肝母细胞瘤，肝细胞瘤，转移性肝 癌等，也可见于婴幼儿肝炎，肝硬化、急性肝炎、重症肝炎恢复等， 但多为一过性升高，胎盘梗塞、剥离、羊水栓塞、高危妊娠、母儿 血型不合、糖尿病孕妇等血清AFP也升高。
15
感染性疾病检测
乙肝五项标志物的定量检测
4、HBcAb
阳性：表示既往感染乙肝病毒，如高抗体水平持续存在提示乙肝 病毒可能还在复制，乙肝病毒感染后，此抗体是最早出现的标志 性抗体，持续时间长，并且几乎所有患者均产生抗体，所以此抗 体是流行病学调查指标。
肿瘤标志物
组织多肽抗原（TPA） 临床意义：主要见于恶性肿瘤；也可见于急性肝炎、胰腺炎、肝 炎等，但增高程度较轻。 前列腺特异性抗原（PSA） 临床意义：主要见于前列腺癌，是前列腺癌首选和最有应用价值 的肿瘤标志物。前列腺增生、前列腺炎、良性前列腺瘤、肾脏和泌 尿生殖系统疾病时，PSA可轻度升高
乙肝五项标志物的检测 3、HBeAg和HBeAb（HBeAg作为乙肝病毒复制增殖的间接指标） HBeAg阳性：说明病毒复制活跃，传染性强，是乙肝患者具有传
染性指标。可见于急、慢性乙肝和乙肝病毒携带者，如持续阳性， 表明乙肝转为慢性迁延性肝炎 HBeAb 在急性肝炎时，此抗体阳性表明乙肝复制缓解或终止，在慢性肝 炎或肝硬化患者，此抗体阳性说明乙肝病毒DNA与肝细胞发生整 合，提示病情较长，预后不佳。
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肿瘤标志物
游离前列腺特异抗原（F-PSA）与F-PSA/PSA比值 临床意义：F-PSA 见于前列腺增生和前列腺癌，但前列腺癌增高 程度不如前列腺增生明显。 F-PSA/PSA降低 见于前列腺癌和前列腺增生，但前列腺癌的降低 程度明显高于前列腺增生 前列腺酸性磷酸酶（PAP） 临床意义：见于前列腺癌、前列腺增生，但前列腺癌增高更明显
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肿瘤标志物
甲胎蛋白（AFP）
临床意义：常见于原发性肝炎、大多数卵巢和睾丸胚胎性肿瘤或 畸胎瘤，生殖腺外生殖细胞瘤，肝母细胞瘤，肝细胞瘤，转移性肝 癌等，也可见于婴幼儿肝炎，肝硬化、急性肝炎、重症肝炎恢复等， 但多为一过性升高，胎盘梗塞、剥离、羊水栓塞、高危妊娠、母儿 血型不合、糖尿病孕妇等血清AFP也升高。
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感染性疾病检测
乙肝五项标志物的定量检测
4、HBcAb
阳性：表示既往感染乙肝病毒，如高抗体水平持续存在提示乙肝 病毒可能还在复制，乙肝病毒感染后，此抗体是最早出现的标志 性抗体，持续时间长，并且几乎所有患者均产生抗体，所以此抗 体是流行病学调查指标。
化学发光PPT课件
A+B → C*, C* → C+hv 该发光反应的化学发光强度取决于反应速度dp/dt和反应 的化学发光量子效率（ ΦCL ）
ICL（T）= ΦCLdp/dt
常用化学发光试剂
A 鲁米诺（luminol）及其衍生物
（3—氨基—邻苯甲酰肼）
在碱性条件下能被许多氧化剂（例如H2O2,O2,ClO-等）氧化而发 出蓝色光，量子产率介于0.01~0.05之间是一个研究最早，最多，
适用范围广
光激发化学发光特点
高灵敏度 低本底 适用范围广
酶的活性、受体-配体反应、低亲和力的反应、第二信使 水平、DNA、RNA、蛋白质、多肽、碳水化合物、小分 子、大分子
易使用 高通量
光激发化学发光
特点：
2. 低本底 第一，天然荧光寿命小，而发光微粒的稳定发光时间超过1秒，可采取时间分辨模式采 集光信号，也就是在激光器关闭后50-100毫秒采集光信号。 第二，由于LiCA采用680nm红光激发，而红光的能级几乎不可能激发生物样品或微孔 板中的荧光物质，故本底很低。 第三，LiCA发射光的波长比激发光的波长短，能量更高，所以称为化学发光。而荧光 是激发光为高能量的而发射光为低能量的。由于生物体内富有天然的荧光物质，用荧 光法测定生物样品本底会较高，而LiCA检测反其道而行之，采用低进高出，有效降低 本底。
CL基本类型
按反应机理 自身化学发光、 敏化化学发光、电致化学发光 自身发光：是指被测物质为反应物直接参与化学反应， 利用自身化学反应释放的能量激发产物分子的光辐射。 可用反应式表示为：
A+B → C*+D， C* → C+hv
这类最普遍，多数有机物分子在液相中的化学反应属于这一类型
CL基本类型
ICL（T）= ΦCLdp/dt
常用化学发光试剂
A 鲁米诺（luminol）及其衍生物
（3—氨基—邻苯甲酰肼）
在碱性条件下能被许多氧化剂（例如H2O2,O2,ClO-等）氧化而发 出蓝色光，量子产率介于0.01~0.05之间是一个研究最早，最多，
适用范围广
光激发化学发光特点
高灵敏度 低本底 适用范围广
酶的活性、受体-配体反应、低亲和力的反应、第二信使 水平、DNA、RNA、蛋白质、多肽、碳水化合物、小分 子、大分子
易使用 高通量
光激发化学发光
特点：
2. 低本底 第一，天然荧光寿命小，而发光微粒的稳定发光时间超过1秒，可采取时间分辨模式采 集光信号，也就是在激光器关闭后50-100毫秒采集光信号。 第二，由于LiCA采用680nm红光激发，而红光的能级几乎不可能激发生物样品或微孔 板中的荧光物质，故本底很低。 第三，LiCA发射光的波长比激发光的波长短，能量更高，所以称为化学发光。而荧光 是激发光为高能量的而发射光为低能量的。由于生物体内富有天然的荧光物质，用荧 光法测定生物样品本底会较高，而LiCA检测反其道而行之，采用低进高出，有效降低 本底。
CL基本类型
按反应机理 自身化学发光、 敏化化学发光、电致化学发光 自身发光：是指被测物质为反应物直接参与化学反应， 利用自身化学反应释放的能量激发产物分子的光辐射。 可用反应式表示为：
A+B → C*+D， C* → C+hv
这类最普遍，多数有机物分子在液相中的化学反应属于这一类型
CL基本类型
化学发光法技术概要ppt课件
主要实验流程（3）——两步法
样本+试剂1（或试剂1+试剂2），37℃孵育5－ 30分钟；
洗涤3-5次，加入试剂3（或试剂3+试剂4）， 37℃孵育5－30分钟；
洗涤3-5次； 加入发光底物， 5-15分钟检测。
16
全自动仪器其他要求
样品加量10µl~200 µl，试剂加量50µl~200 µl， 随检测项目不同而有所增减。
化学发光法技术概要 及自动化免疫分析仪 技术要点
科华生物研发中心光免小组 李基
2010.7.14
1
化学发光法反应基本原理
➢ 抗原-抗体反应
抗体能够特异性识别相对应的抗原，并与之结合，这种反 应称之为抗原抗体反应。 抗原-抗体反应具有特异性、敏感性、可逆性等特点。
➢ 酶促底物发光
将检测试剂中的抗原或抗体用碱性磷酸酶（AP）加以标 记，通过发光底物测定相对光子数（RLUs值），来检测 目标抗体或抗原的浓度。
2
化学发光法反应模式
一步法 （15min反应+15min显色）
➢ 夹心法 ➢ 竞争法
两步法 （15min+15min反应+15min显色）
➢ 间接法 ➢ 捕获法
3
一步法：夹心法
4
一步法：竞争法
5
两步法：间接法
6
两步法：捕获法
7化学发光法ຫໍສະໝຸດ 应介质✓ 固相介质：磁珠 ✓ 酶标记物：碱性磷酸酶（AP） ✓ 发光底物：AMPPD
第一个结果报告时间（min ）
检测通量（T/hour）
10
68-120
15.6
200
<15.6
1200
18
240
15
样本+试剂1（或试剂1+试剂2），37℃孵育5－ 30分钟；
洗涤3-5次，加入试剂3（或试剂3+试剂4）， 37℃孵育5－30分钟；
洗涤3-5次； 加入发光底物， 5-15分钟检测。
16
全自动仪器其他要求
样品加量10µl~200 µl，试剂加量50µl~200 µl， 随检测项目不同而有所增减。
化学发光法技术概要 及自动化免疫分析仪 技术要点
科华生物研发中心光免小组 李基
2010.7.14
1
化学发光法反应基本原理
➢ 抗原-抗体反应
抗体能够特异性识别相对应的抗原，并与之结合，这种反 应称之为抗原抗体反应。 抗原-抗体反应具有特异性、敏感性、可逆性等特点。
➢ 酶促底物发光
将检测试剂中的抗原或抗体用碱性磷酸酶（AP）加以标 记，通过发光底物测定相对光子数（RLUs值），来检测 目标抗体或抗原的浓度。
2
化学发光法反应模式
一步法 （15min反应+15min显色）
➢ 夹心法 ➢ 竞争法
两步法 （15min+15min反应+15min显色）
➢ 间接法 ➢ 捕获法
3
一步法：夹心法
4
一步法：竞争法
5
两步法：间接法
6
两步法：捕获法
7化学发光法ຫໍສະໝຸດ 应介质✓ 固相介质：磁珠 ✓ 酶标记物：碱性磷酸酶（AP） ✓ 发光底物：AMPPD
第一个结果报告时间（min ）
检测通量（T/hour）
10
68-120
15.6
200
<15.6
1200
18
240
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常见化学发光技术PPT课件
02
它利用化学反应过程中释放的能 量激发发光物质，使其发出特定 波长的光，从而实现物质的检测 。
化学发光技术的原理
当某些物质被某种能量激发时，这些 物质会吸收能量并跃迁至激发态。
在化学发光反应中，通常需要加入特 殊的化学物质作为发光物质，这些物 质在反应过程中被激发并发出光辐射 。
当这些物质从激发态回到基态时，会 以光子的形式释放能量，从而产生光 辐射。
化学发光反应通常比较简单，所需的仪器 设备相对不复杂，操作简便，检测快速。
缺点
背景光干扰
化学发光反应中可能伴随有背景光的产生 ，对检测结果造成干扰，影响检测的准确
性。
特定性不强
某些化学发光反应可能不仅仅与目标物质 发生反应，也可能与其他类似物质发生反
应，导致检测的特异性不够强。
试剂昂贵且不稳定
某些化学发光试剂比较昂贵且容易分解变 质，需要妥善保存，增加了实验成本和难 度。
03
CATALOGUE
化学发光技术的优缺点
优点
高灵敏度
宽线性范围
化学发光技术具有很高的灵敏度，能够检 测到极低浓度的物质，因此在生物医学、 环境监测和食品安全等领域有广泛应用。
该技术线性范围较宽，可以适应不同浓度 的样品检测，减少了样品稀释和浓缩的繁 琐步骤。
非放射性
简单快捷
化学发光反应产生的光子不带电荷，因此 没有放射性污染，对实验人员和环境安全 。
在生物医学研究中的应用
蛋白质组学研究
利用化学发光技术对蛋白 质进行标记和检测，有助 于蛋白质相互作用、定位 和功能研究。
基因表达分析
通过化学发光技术检测基 因表达水平，研究基因调 控和疾病发生机制。
细胞成像与定位
利用化学发光技术对细胞 内分子进行标记和成像， 研究细胞结构和功能。
它利用化学反应过程中释放的能 量激发发光物质，使其发出特定 波长的光，从而实现物质的检测 。
化学发光技术的原理
当某些物质被某种能量激发时，这些 物质会吸收能量并跃迁至激发态。
在化学发光反应中，通常需要加入特 殊的化学物质作为发光物质，这些物 质在反应过程中被激发并发出光辐射 。
当这些物质从激发态回到基态时，会 以光子的形式释放能量，从而产生光 辐射。
化学发光反应通常比较简单，所需的仪器 设备相对不复杂，操作简便，检测快速。
缺点
背景光干扰
化学发光反应中可能伴随有背景光的产生 ，对检测结果造成干扰，影响检测的准确
性。
特定性不强
某些化学发光反应可能不仅仅与目标物质 发生反应，也可能与其他类似物质发生反
应，导致检测的特异性不够强。
试剂昂贵且不稳定
某些化学发光试剂比较昂贵且容易分解变 质，需要妥善保存，增加了实验成本和难 度。
03
CATALOGUE
化学发光技术的优缺点
优点
高灵敏度
宽线性范围
化学发光技术具有很高的灵敏度，能够检 测到极低浓度的物质，因此在生物医学、 环境监测和食品安全等领域有广泛应用。
该技术线性范围较宽，可以适应不同浓度 的样品检测，减少了样品稀释和浓缩的繁 琐步骤。
非放射性
简单快捷
化学发光反应产生的光子不带电荷，因此 没有放射性污染，对实验人员和环境安全 。
在生物医学研究中的应用
蛋白质组学研究
利用化学发光技术对蛋白 质进行标记和检测，有助 于蛋白质相互作用、定位 和功能研究。
基因表达分析
通过化学发光技术检测基 因表达水平，研究基因调 控和疾病发生机制。
细胞成像与定位
利用化学发光技术对细胞 内分子进行标记和成像， 研究细胞结构和功能。
光激化学发光技术介绍
GG-SA
Biotin-HBcAg
Anti-HBc- FG
检测平台
LiCA SP
• 双加样臂 • 气置换式微量进样泵 • 液面自动检测功能 • 标本、试剂装载
– 100个标本 – 10个试剂位
LiCA HT
• 一次装载300个测试 • 自动高速进样：0.5秒/
孔 • 自动温育、震荡和读数 • 300个测试仅需50分钟
基本包被模式
GG-Streptavidin（SA）
FG- Antibody（Ab）
基本反应模式
biotin-antigen
primary Ab
secondary Ab (or protein A, G, LA)
• 配体－受体 应用类型
• 激酶 • 蛋白－蛋白 • 免疫 • 蛋白酶
TNFa-sTNFR1 配体－受体(1)
LiCA发光原理
• 核心原理是能量的近距离转移 • 转移的介质是高能态离子氧 • 红色激光680nm照射，感光微粒释放离子氧（4微秒），传播直
径200nm，发光微粒（520～618nm），高能级的光 • 反应的基础有赖于两种微粒的相互接近 • 反应体系中，微粒的浓度很低，碰撞机率很低，本底信号微弱
Bioti -TNFa sTNFR1 n
anti-TNFR1 IgG
Protein FG A-
TNFa-sTNFR1 配体－受体(1)
GG-SA
Bioti -TNFa sTNFR1 n
anti-TNFR1 IgG
Protein FG A-
TNFa-sTNFR1 配体－受体(1)
GG-SA
Bioti -TNFa sTNFR1 n
GG-SA
Bioti -anti- TNFa n TNFa
化学发光法的原理技术要点及评价应用 PPT
• 按分离方法不同分 1.微粒子化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定
第一节 发光与化学发光剂
一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。
1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。
2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。
技术要点
1.抗原抗体结合反应 将包被McAb的磁颗粒和待 测标本加入到反应管中，标本中待测Ag与磁珠 上Ab结合，再加上AE标记Ab，经过温育，形成 磁珠Ab-Ag-AE标记Ab复合物。
2.分离技术 在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快 地将未结合的多余Ag和标记Ab洗去。
3.化学发光反应 经洗涤的磁珠中，加入H2O2和 pH纠正液NaOH，这时AE不需要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记 录1S内所产生的光子能，其积分与被测物含量
体料是通包微 利过被珠 光用酶强度对标 记 的发抗 光测体 定底而物样抗 本原催直接化进作A M行用P P定而D 量直。接发光，
电化学发光原理图
• 这一过程可在电极表面周而复始地进行 • 产生许多光子，使光信号增强
TPA+●
电极
●
TPA
R u ( b p y )33 +
R u ( b p y )32 +
常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）
CH 3
N+
- HO 2
CO
O
R
CH 3 N
O CO O
R
CH 3 N
O CO O
+ CO2+ 光
第一节 发光与化学发光剂
一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。
1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。
2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。
技术要点
1.抗原抗体结合反应 将包被McAb的磁颗粒和待 测标本加入到反应管中，标本中待测Ag与磁珠 上Ab结合，再加上AE标记Ab，经过温育，形成 磁珠Ab-Ag-AE标记Ab复合物。
2.分离技术 在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快 地将未结合的多余Ag和标记Ab洗去。
3.化学发光反应 经洗涤的磁珠中，加入H2O2和 pH纠正液NaOH，这时AE不需要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记 录1S内所产生的光子能，其积分与被测物含量
体料是通包微 利过被珠 光用酶强度对标 记 的发抗 光测体 定底而物样抗 本原催直接化进作A M行用P P定而D 量直。接发光，
电化学发光原理图
• 这一过程可在电极表面周而复始地进行 • 产生许多光子，使光信号增强
TPA+●
电极
●
TPA
R u ( b p y )33 +
R u ( b p y )32 +
常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）
CH 3
N+
- HO 2
CO
O
R
CH 3 N
O CO O
R
CH 3 N
O CO O
+ CO2+ 光
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感光微球
A
C
发光微球
光激化学发光技术介绍
➢ 高灵敏度
• 信号产生逐级放大的结果 • 每个感光微粒释放出近6万个离子氧 • 离子氧作用于二甲基噻吩，产生大量紫外光 • 紫外光激发镧系元素
实际检测能力为10-15摩尔 理论检测能力为10-18摩尔
光激化学发光技术介绍
➢ 低本底 • 时间分辨模式采集光信号（延迟150 ms），天然荧光的寿 命小于100 ns • 采用680 nm红光激发，生物样品中的荧光物质不敏感 • 发射光的波长比激发光的波长短，能量更高，有别于荧光， 有效避免荧光物质干扰
光激化学发光技术介绍 ERa-DNA
Biotin -ERa DNA -digoxigenin
anti-digoxigenin-FG
光激化学发光技术介绍 ERa-ERE
GG-SA
Biotin -ERa DNA -digoxigenin
anti-digoxigenin-FG
光激化学发光技术介绍
HBsAg
光激化学发光技术介绍
GG-Streptavidin（SA）
FG- Antibody（Ab）
光激化学发光技术介绍
biotin-antigen
primary Ab
secondary Ab (or protein A, G, LA)
光激化学发光技术介绍 ➢ 配体－受体 ➢ 激酶 ➢ 蛋白－蛋白 ➢ 免疫 ➢ 蛋白酶 ➢ 蛋白－DNA
GG-SA
Biotin -TNFa sTNFR1 anti-TNFR1 IgG Protein A- FG
光激化学发光技术介绍
环磷酸腺苷 cAMP
Biotin- cAMP
anti-cAMP- FG
光激化学发光技术介绍
环磷酸腺苷 cAMP
GG-SA
Biotin- cAMP
anti-cAMP- FG
光激化学发光（LiCA）
Light Initiated Chemiluminescence Assay
光激化学发光技术介绍
➢ 以高分子微粒为基础 • 两种微粒近距离 • 离子氧能量传递
➢ 主要特点： • 高灵敏度 • 低本底 • 稳定 – 均相 – 免洗
➢ 广泛应用于生物分子间的相互作用
光激化学发光技术介绍
光激化学发光技术介绍 TNFa-sTNFR1
Biotin -TNFa sTNFR1 anti-TNFR1 IgG Protein A- FG
光激化学发光技术介绍 TNFa-sTNFR1
GG-SA
Biotin -TNFa sTNFR1 anti-TNFR1 IgG Protein A- FG
光激化学发光技术介绍 TNFa-sTNFR1
光激化学发光技术介绍 Akt
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
光激化学发光技术介绍 Akt
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
光激化学发光技术介绍
Akt
Akt 磷酸化
GG-SA
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
Anti-GST- FG
光激化学发光技术介绍
肿瘤坏死因子 TNFa
Biotin - anti-TNFa
TNFa
anti-TNFa- FG
光激化学发光技术介绍
肿瘤坏死因子 TNFa
GG-SA
Biotin - anti-TNFa
TNFa
anti-TNFa- FG
光激化学发光技术介绍
肿瘤坏死因子 TNFa
GG-SA
Biotin - substrate - digoxigenin anti-digoxigE
ACE 切割
Biotin- angiotensin I
anti-angiotensin II- FG
光激化学发光技术介绍 ACE
GG-SA
Biotin - angiotensin I I anti-angiotensin II- FG
GG-SA
Biotin-Anti-HBs
HBsAg
Anti-HBs-FG
Anti-HBs
GG-SA Biotin-HBsAg
Anti-HBs
HBsAg- FG
HBeAg
GG-SA
Biotin-Anti-HBe
HBeAg
Anti-HBe- FG
Anti-HBe
Sample Anti-HBe
➢ 感光微粒内含感光化合物 ➢ 发光微粒内含发光化合物和镧系元素 ➢ 微粒直径188nm，表面覆盖水凝胶 ➢ 共价连接 ➢ 增大的表面积 ➢ 成百上千个生物分子，捕获目标分子
光激化学发光技术介绍
➢ 核心原理是能量的近距离转移 ➢ 转移的介质是高能态离子氧 ➢ 红色激光680nm照射，感光微粒释放离子氧（4微秒），传播
GG-SA Biotin-anti-TNFa TNFa
anti-TNFa Protein A- FG
光激化学发光技术介绍
肿瘤坏死因子 TNFa
GG-SA
Biotin-anti-TNFa TNFa
anti-TNFa Protein A- FG
光激化学发光技术介绍
组织蛋白酶 Cathepsin D
Cathepsin D 水解
光激化学发光技术介绍
Akt
Akt
GG-SA
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
光激化学发光技术介绍 p53/HDM2
Biotin -p53
HDM2-GST
Anti-GST- FG
光激化学发光技术介绍 p53/HDM2
GG-SA
Biotin -p53
HDM2-GST
LiCA的技术特点（三）
➢ 稳定
• 均相环境使反应更充分 • 免洗操作杜绝随机误差和交叉污染 • 感光和发光的有机分子受到微粒的保护，环境稳定和安全 • 溶液中的氧浓度是一个常数 • 不易受到pH值、离子强度和温度的影响
广泛应用
➢ 临床免疫的各项检测 ➢ 生命科学的基础研究 ➢ 新药的筛选 ➢ 标记简便 ➢ 检测过程简单
直径200nm，发光微粒（520～618nm），高能级的光 ➢ 反应的基础有赖于两种微粒的相互接近 ➢ 反应体系中，微粒的浓度很低，碰撞机率很低，本底信号微弱
激发光 680 nm
光激化学发 光技术介绍
发射光
1O2
520-620 nm
感光微球
A
B
200nm
发光微球
激发光 680 nm
原理 (2)
O2-