酶活力测定的一般原理和方法
酶活力测定方法
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化 学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力 越高。
酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应 进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速 度的测定，求得酶的浓度或含量。
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化 量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速 度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶 量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适 宜。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了解蛋白酶活力测定的原理；2、掌握蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；② 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）；③ 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④ 5%三氯醋酸（TCA）溶液。
四、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min（准确计时）后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
酶的活力测定的原理是
酶的活力测定的原理是
酶的活力测定原理是通过测量酶催化下的反应速率来间接测定酶的活力。
一般情况下，可以在一定温度、pH值和底物浓度下进行反应，然后通过测量反应产物的生成速率或底物的消耗速率来确定酶的活力。
常用的酶活力测定方法有比色法、荧光法、化学发光法、电化学法等。
其中，比色法是最常用的方法之一。
比色法的原理是将产物或底物与某种试剂作用，使其产生特定的吸光度变化，然后根据吸光度的变化来计算酶的活力。
03 实验三 碱性蛋白酶活力测定
实验三. 碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
蛋白酶活性检验方法
蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。
2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。
2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
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兴趣小组分别对酶保护剂浓度、提取液pH进行了探究实验。 结果显示，酶保护剂浓度在0.02～0.06mol/L范围内，酶活力较 高；提取液pH在6.0～8.0范围内，酶活力较高。他们认为，要进 一步提高粗酶制剂的酶活力，以达到最佳提取效果，还需对酶保 护剂浓度和提取液pH进行优化，并确定以此为探究课题。请拟定 该课题名称，设计实验结果记录表。
(1)pH对不同蛋白酶的活力影响有差异。据图12可知，木__瓜__蛋__白__酶_ 更适宜作为食品添加剂，理由是_由__图__可__以__看__出__，__木__瓜__蛋__白__酶__的_ _活__性__不__随__p_H_的__变__化__而__变__化_____________________。 蛋白酶的活力可用单__位__时__间__内__底__物__消__耗__（__产__物__产__生__）的量来表示。
（2008江苏34A题）。为探究洗衣粉加酶后的洗涤效果，将一种 “汉水丑生的生物同行”超级群大型公 益活动：历年高考题PPT版制作。本
课件为公益作品，版权所有，不得以 任何形式用于商业目的。2012年1月15 日，汉水丑生标记。
无酶洗衣粉分成3等份，进行3组实验。甲、乙组在洗衣粉中加
入1种或2种酶，丙组不加酶，在不同温度下清洗同种化纤布上
(2)该蛋白酶的提取工艺流程如下：
课题：探究酶保护剂的最适浓度和提取液的最适pH
单位时
提取液的pH
间内底
物的消 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 耗量
酶 0.02 保 0.03 护 剂 0.04 的 0.05 浓 度 0.06
【解析】 （1）审题结合图形和文字，在题目中已经提供了信息“食 品种类多，酸碱度范围广”，所以选择的食品添加剂应该有 较广的酸碱适应范围。从图形中，可以看出木瓜蛋白酶的适 应范围最广，所以可以选作食品添加剂。酶的活力，一般用 酶催化的底物消耗量或者产物生成量来表示。 （2）实验设计，应该明确实验目的：探究酶保护剂的最适 浓度和提取液的最适pH值，所以可以将酶保护剂的浓度和提 取液的pH值作为自变量，因变量为单位时间内底物的消耗量。
清除血渍时间(min) 67 66 88 52 51 83 36 34 77 11 12 68 9 11 67
清除油渍时间(min) 93 78 95 87 63 91 82 46 85 75 27 77 69 8 68
（3）如果甲、乙和丙3组均在水温为80℃时洗涤同一种污渍， “汉水丑生的生物同行”超级群大型公 益活动：历年高考题PPT版制作。本 课件为公益作品，版权所有，不得以 任何形式用于商业目的。2012年1月15 日，汉水丑生标记。
的2种污渍，其他实验条件均相同，下表为实验记录。请回答下
列水问温题/℃。
10
20
30
40
50
组别
甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲乙丙
清除血渍时间(min) 67 66 88 52 51 83 36 34 77 11 12 68 9 11 67
清除油渍时间(min) 93 78 95 87 63 91 82 46 85 75 27 77 69 8 68
29 ．（16分）食品种类多，酸碱度范围广。生物兴趣小组拟 探究在食品生产应用范围较广的蛋白酶，查阅相关文献，得知：
(2)该蛋白酶的提取工艺流程如下：
“汉水丑生的生物同行”超级群大型 公益活动：历年高考题PPT版制作。
本课件为公益作品，版权所有，不得 以任何形式用于商业目的。2012年1月 15日，汉水丑生标记。
A题。为探究洗衣粉加酶后的洗涤效果，将一种无酶洗衣粉分成 3等份，进行3组实验。甲、乙组在洗衣粉中加入1种或2种酶， 丙组不加酶，在不同温度下清洗同种化纤布上的2种污渍，其他 实验条件均相同，下表为实验记录。请回答下列问题。
水温/℃
10
20
30
40
50
组别
甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲乙丙
10
20
30
40
50
组别
甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲乙丙
清除血渍时间(min) 67 66 88 52 51 83 36 34 77 11 12 68 9 11 67
（1）提高洗衣粉去污能力的方法有_加___酶__和__适___当__提___高__温__度____。 甲组在洗衣粉中加入了_蛋__白__酶___。乙组在洗衣粉中加入了 ____蛋__白___酶__和___脂__肪__酶_________。 （2）甲、乙组洗涤效果的差异，说明酶的作用具有_专___一__性____。
酶活力测定的一般原理和方法
（2012广东29 ）．（16分）食品种类多，酸碱度范围广。生 物兴趣小组拟探究在食品生产应用范围较广的蛋白酶，查阅相 关文献，得知：
“汉水丑生的生物同行”超级群大型 公益活 动：历年高考题PPT版制作。本课件 为公益 作品，版权所有，不得以任何形式用 于商业 目的。2012年1月15日，汉水丑生标记 。
请比较这3组洗涤效果之间的差异并说明理由。
没有差异，因为高温使酶失活
A题。为探究洗衣粉加酶后的洗涤效果，将一种无酶洗衣粉分成 3等份，进行3组实验。甲、乙组在洗衣粉中加入1种或2种酶， 丙组不加酶，在不同温度下清洗同种化纤布上的2种污渍，其他 实验条件均相同，下表为实验记录。请回答下列问题。
水温/℃
成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产
生_透__明___圈___，可根据其大小选择目的菌株，所得菌
株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸
钠作为底物，活性可用一定条件下单位时
间__植__酸__钠__的__消__耗__量__（__肌__醇__和__磷__酸__的__生__成__量__）__表示。
（2009广东38 “汉水丑生的生物同行”超级群大型公 益活动：历年高考题PPT版制作。本
课件为公益作品，版权所有，不得以 任何形式用于商业目的。2012年1月15 日，汉水丑生标记。
（1））.（10分）生物技术实践
商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过
程中