酶活性测定方法
酶活性测定的方法
酶活性测定的方法
1. 分光光度法：利用酶反应所产生的光学变化，测定吸光度的变化来推断酶活性的大小。
2. 电化学法：利用酶催化反应产生的电化学反应，测定电流的变化来推断酶活性的大小。
3. 比色法：利用酶反应所产生的还原物或氧化物使某一与之相应的指示剂发生颜色变化，来推断酶活性的大小。
4. 管道法：将酶溶液、底物和指示剂分装在不同的细管内，然后加入底物的初始剂量使反应开始，观察指示剂的变化时间来推断酶活性的大小。
5. 放射性测定法：利用放射性同位素标记底物或产物，测定其放射性的变化来推断酶活性的大小。
4.1酶活性测定有哪些方法
③由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以 大大地扩展(无需S、P间有特性差异)
④除上述两法外还有其他一些方法：平衡法
平衡法（又称终点法）
通过测定酶反应开始至反应达到平衡时 产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方 法。
谢 谢！
优点：动态了解反应v,易区分零级和一级反应期及延滞期 缺点：a.测定时需保温
b.检测有限制：△被测物S与P间理化特性要有差异 △显色剂对酶活性无影响
保温装置
注意：
①连续监测法测定包括了: 延滞期、线性期、非线性期(动态期)v 平衡期v
动态定量描述：早期称动态法
②速度计算;
a.线性期，初v符合米氏方程的变量关系
定时法可能引起的误差
A.两点间呈线性（少见） B.线性期短，大部分
为非线性(最常见) C.包括了延滞期 D.包括延滞期和非线性部分
∵测定不够准确，
实际测得平均v 结果偏低
定时法可能引起的误差示义图
[P]
A
D
C
B
t0
t
t
连续监测法：
定义：连续 (间隔15”~1’)测定酶反应过程中某一反应产物 或底物浓度随时间的变化来求酶反应初速度的方 法 — 动力学方法, 速率法
非线性期v不能简单地按米氏方程的计算它是表观速度vapp或称反应净速度存在逆反应实际酶测定时的时间进程曲线图表观速度vappor称反应净速度vms常数kss常数由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以大大地扩展无需sp间有特性差异除上述两法外还有其他一些方法
酶活性测定有哪些方法
Progress curve of a typical enzyme reaction
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
土壤酶活性的测定方法
土壤酶活性的测定方法土壤酶活性的测定方法主要包括测定土壤中的蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等多种酶活性，这些酶活性的测定可以反映土壤的微生物代谢能力和土壤质量。
本文将详细介绍几种常用的土壤酶活性测定方法。
一、酶活性测定方法的准备工作1. 样品处理：收集土壤样本后，将其放在4C冷藏保存，保持样品活性，避免酶的降解。
2. 取样：根据需要，从土壤样品中取出一定量的湿重或干重样品。
3. 土壤处理：依据实验要求，对土壤样品进行处理，如水分调整、添加营养物质等。
二、蔗糖酶活性测定方法蔗糖酶是一种常见的土壤酶，可反映土壤中的碳循环能力。
蔗糖酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤，去除杂质。
2. 准备培养基：其中包括蔗糖作为底物、缓冲液、指示剂等。
3. 加入适量的土壤样品和培养基到离心管中，混匀后，放置在恒温摇床上培养一定时间。
4. 培养结束后，通过离心将土壤颗粒沉淀到底部。
5. 取沉淀后的上清液，用酚酞指示剂进行比色检测，根据比色结果计算蔗糖酶活性。
三、脲酶活性测定方法脲酶是一种重要的土壤酶，参与土壤中尿素的分解过程。
脲酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，在10C恒温条件下接种脲酶底物，使底物完全被土壤降解。
2. 在一定时间后，通过添加草酸溶液阻止进一步反应，停止脲酶的活性。
3. 取样品，加入酚硫酸溶液，进行比色测定。
4. 根据比色结果计算脲酶活性。
四、过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可反映土壤的抗氧化能力。
过氧化氢酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤去除杂质。
2. 准备含过氧化氢底物和其他试剂的反应体系。
3. 将土壤样品加入反应体系中，充分混匀后，在一定时间内反应。
4. 在反应结束后，通过添加硫酸钠溶液停止反应，阻止进一步的化学反应。
5. 使用紫外分光光度计测定样品的吸光度，根据结果计算过氧化氢酶活性。
五、过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶是一类重要的土壤酶，在土壤中参与有机物降解和氧化还原反应。
酶活性测定方法
体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液。
处理后湿纱布覆盖并用P E塑料膜密封作保湿处理。
贮藏于常温（20-25℃）下。
分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。
取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。
研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。
取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100m L 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100m g 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。
测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。
2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。
荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。
3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。
通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。
5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。
需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。
食品中酶活性的测定方法与作用评价
食品中酶活性的测定方法与作用评价食品中的酶活性是指食品中含有的酶的活性水平。
酶是一种能够加速化学反应速率的蛋白质分子，它们在生物体内起着至关重要的作用。
在食品中，酶的活性对于食品的品质、储存和加工都有着深远的影响。
因此，准确测定食品中的酶活性，并评价其对食品的作用，对于食品工业及消费者来说都具有重要意义。
目前，常见的测定食品中酶活性的方法主要有两种，分别是酶动力学法和酶质谱分析法。
酶动力学法通过测定酶催化反应速率的变化来间接测定酶的活性。
首先，确定反应所需的底物和酶的适宜浓度，然后通过改变反应体系中底物或酶的浓度，观察反应速率的变化。
利用这种方法，可以推算出酶的催化反应速率常数和底物的最大转化速率。
最常用的是Michaelis-Menten动力学方程和Lineweaver-Burk双倒数图法。
酶动力学法可以测定食品中多种酶的活性，并通过调整酶活性来改善食品的加工性和品质。
酶质谱分析法则是通过质谱仪的技术手段直接测定酶的活性。
质谱仪是一种能够测定物质分子质量的仪器，通过将食品样品中的酶分子离子化，并根据其质量比例进行分离和测定。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以在食品中快速、准确地确定酶的活性水平，但由于设备复杂和价格昂贵，应用较为有限。
无论使用何种方法进行酶活性的测定，评价酶在食品中的作用都是至关重要的。
首先，酶活性的测定可以评价食品的新鲜度。
以水果为例，水果中的酶在成熟过程中发挥着重要的作用。
通过测定水果中的酶活性，可以了解水果的成熟程度和品质。
当果实成熟时，酶的活性会降低，从而导致果肉变软、变甜。
相反，当果实过度成熟或腐烂时，酶活性将会增加，导致果肉褐变和气味恶化。
因此，通过监测酶活性可以及时评估水果的新鲜度，对于确定最佳食用时机具有重要意义。
其次，酶活性的测定可以评价食品的加工品质。
食品加工过程中，酶常常被用于提高食品的口感和质感。
以面包为例，加入面团中的面包酵母能够产生酶来催化面团中的淀粉转化为糖，从而使面包更加松软和香甜。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
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一、过氧化物酶（POD）活性的测定
POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V T
POD活性=
0.01×t×Vs×W
式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；
V T ----提取酶液的总体积（ml）
t----反应的时间（min）
Vs ----测定时取用酶液体积（ml）
W----样品鲜重（g）
二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定
多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T
0.01×t×0.5g×V s
= O D×V T
0.005
OD——反应时间内吸光值的变化；
V T ----提取酶液的总体积（ml）
Vs ----测定时取用酶液体积（ml）
T———反应时间(min)；
三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定
参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
标准曲线的制定，配制浓度0~ 250 μg/ml的IAA溶液，分别在530nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。
IAAO活性测定：量取1ml 酶液+2ml 1mmol/L MnCl2 +1ml 1mmol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+5mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液，放入30℃的水浴中30min,对照为2ml 1mol/L的MnCl2+1ml 1mol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+6ml PH=6.0 磷酸缓冲液。
将上述溶液吸取2ml，与4ml反应液（0.5mol/L的FeCl31.0ml+35%的过氯酸30ml）混合置于黑暗处，30℃条件下保存30min，最后测定530nm下的吸光度，并计算酶活性。
IAAO活性以每mg蛋白质在1h内分解破坏1μg IAA的酶量表示酶活性大小。
（C 1- C2）×V T
吲哚乙酸氧化酶活性=
W×t×V1[μg/ （g·h ）]
式中：C1——对照管在标准曲线上查得IAA, μg ；
C2 ——测定管在标准曲线上查得IAA, μg ；
V T——酶液稀释后总体积，mL ；V1——酶液反应时用体积，mL
W ——样品重量，g ；t ——酶促时间，h
四、超氧物歧化酶（SOD）活性的测定
多酚氧化酶活性测定参照赵世杰等的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5ml 0.05mol/L磷酸缓冲液（PH=7.8），冰浴研磨成浆，4℃条件下10000r/min离心10min后上清液即为酶液。
SOD活性测定：反应试管中分别加入1.5 mL磷酸缓冲液，0.3 mL130m mol ／L的Met溶液，0.3 mL750μmol/LNBT溶液，0.3 mL100μmol/LEDTA-Na2溶液，0.3 mL20μmol/L核黄素，0.25mL蒸馏水，0.05 mL的酶液（对照加缓冲液，2支）。
混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，温度低可适当延长）。
反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光光化还原的50﹪为一个酶活性单位表示。
SOD总活性=[(A ck-A E)×V]／[A ck×1／2×W×a]
SOD比活力=SOD总活性／蛋白质浓度
SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示；
A ck--照光对照管的消光度值；A E—样品管的消光度值；
V—样液总体积（ml）； a—测定时样品用量（ml）
W—样重(g)
蛋白质浓度单位为：mg蛋白／g样重
五、过氧化氢（CAT）活性的测定
0.15 mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液
反应液配制：取200mlPBS（0.15mol，PH=7.0），加入0.3092ml 30‰的H2O2（原液摇匀即可）
酶液制备：称取样品0.2g，加入5ml 0.15mol/L磷酸缓冲液（PH=7.0），冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。
样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（μ）
CAT=[△A240×Vt]／（0.01×t×W×V s）（μ／g.min）
△A240—反应时间内吸光度的变化
W—样品鲜重（g）
t—反应时间（min）
Vt—提取酶液总体积（ml，1.6ml）
V s—测定时取用酶液体积（ml，0.1ml）。