酶活性测定方法
酶活性测定的方法
酶活性测定的方法
1. 分光光度法：利用酶反应所产生的光学变化，测定吸光度的变化来推断酶活性的大小。
2. 电化学法：利用酶催化反应产生的电化学反应，测定电流的变化来推断酶活性的大小。
3. 比色法：利用酶反应所产生的还原物或氧化物使某一与之相应的指示剂发生颜色变化，来推断酶活性的大小。
4. 管道法：将酶溶液、底物和指示剂分装在不同的细管内，然后加入底物的初始剂量使反应开始，观察指示剂的变化时间来推断酶活性的大小。
5. 放射性测定法：利用放射性同位素标记底物或产物，测定其放射性的变化来推断酶活性的大小。
4.1酶活性测定有哪些方法
③由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以 大大地扩展(无需S、P间有特性差异)
④除上述两法外还有其他一些方法：平衡法
平衡法（又称终点法）
通过测定酶反应开始至反应达到平衡时 产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方 法。
谢 谢！
优点：动态了解反应v,易区分零级和一级反应期及延滞期 缺点：a.测定时需保温
b.检测有限制：△被测物S与P间理化特性要有差异 △显色剂对酶活性无影响
保温装置
注意：
①连续监测法测定包括了: 延滞期、线性期、非线性期(动态期)v 平衡期v
动态定量描述：早期称动态法
②速度计算;
a.线性期，初v符合米氏方程的变量关系
定时法可能引起的误差
A.两点间呈线性（少见） B.线性期短，大部分
为非线性(最常见) C.包括了延滞期 D.包括延滞期和非线性部分
∵测定不够准确，
实际测得平均v 结果偏低
定时法可能引起的误差示义图
[P]
A
D
C
B
t0
t
t
连续监测法：
定义：连续 (间隔15”~1’)测定酶反应过程中某一反应产物 或底物浓度随时间的变化来求酶反应初速度的方 法 — 动力学方法, 速率法
非线性期v不能简单地按米氏方程的计算它是表观速度vapp或称反应净速度存在逆反应实际酶测定时的时间进程曲线图表观速度vappor称反应净速度vms常数kss常数由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以大大地扩展无需sp间有特性差异除上述两法外还有其他一些方法
酶活性测定有哪些方法
Progress curve of a typical enzyme reaction
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
酶活性测定方法
体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液。
处理后湿纱布覆盖并用P E塑料膜密封作保湿处理。
贮藏于常温（20-25℃）下。
分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。
取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。
研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。
取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100m L 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100m g 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。
测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。
2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。
荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。
3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。
通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。
5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。
需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
酶工程第1章酶活性单位及其测定方法
1 分光光度法
（spectrophotometry）
硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加
入的显色剂对－氨基苯磺酸和α －萘胺反应生成玫 瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物 的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶， NAD+ 或NADP + 在340nm处光吸收很少，而其还原
1000 0.3 15 μmol/min/mg protein 20
U/mg protein
二、酶活性测定的主要方法
温度、pH、离子强度（I=(1/2)Σ CZ 2 ）等因 素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采 用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子， 应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级 反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有 关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物 浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应 速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度， 即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应 了的底物不超过5%）。
物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分
离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或
沉淀，就易于分离。
5 电化学方法
（electrochemistry）
① pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生H＋ 或减少H＋的反应来说，用1/1000 pH单位精度的pH 计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入 酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 ② 电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物 和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微 电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变 化。 ③ 电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流 变化。
1 katal＝6×107 IU
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶活性测定
1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)
试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）
0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer
0.2mol/L NaOH
测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；
(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；
(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；
(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：
每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)
2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)
试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）
0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer
0.2mol/L NaOH
测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；
(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；
(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；
(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：
每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)
3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)
试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）
0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)
测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；
(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化
60 min；
(3) 沸水加热3min 终止反应；
(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：
每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.299 (Eu)
4、蛋白酶(Protease)
试剂：0.5% azocasein（偶氮酪蛋白）
测定步骤：(1) 加入样品之前，0.5% azocasein及0.2mol/L NaOH 37°C孵化30 min；
(2) 3mL污泥样品+1mL 0.5% azocasein 37°C孵化90 min；
(3) 加入2 ml 10% 三氯乙酸(TCA) 终止反应；
(4) 2500g 离心，2mL上清液加入2mL NaOH在440nm测定吸光度。
计算：
每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*2.22 (Eu)
5、脱氢酶(Dehydrogenese)
试剂：0.2% INT（碘硝基四唑）
测定步骤：(1) 加入样品之前，0.2% INT及去离子水37°C孵化30 min；
(2) 2mL污泥样品+1.5mL 0.2% INT+ 3mL 去离子水37°C孵化30 min；
(3) 加入0.5 ml 37% 福尔马林终止反应；
(4) 4°C 1500g 离心，排掉上清液，加入5mL 4+6 四氯乙烯/丙酮，4°C 避光静置30 min，1500g 离心10min，490nm测定上清液吸光度。
计算：
每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.884 (Eu)。