蛋白质一级结构测定
蛋白质一级结构测定
氨基酸与肽的定量组成测定
定量组成测定，第一步是将蛋白质水解 为基组成氨基酸。 蛋白质的水解方法有： 1、酸水解法：用6MHCl于100~120℃下在真 空的安瓿瓶内进行，水解10~24小时
特点： （1）所得的氨基酸不消旋；但色氨酸全部被破坏。 （2）天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来而转 变为相应的氨基酸，酰胺基的总量由产生的氨算出。
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蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中 氨基酸的组成、排列顺序连接方式和 二硫键的位置。 在生物化学与分子生物学中不少问题 都面临着需要知道蛋白质一级结构的 情况。如研究蛋白质的结构与功能的 关系、酶的结构与功能的关系、一级 结构与高级结构的关系等。因此，只 有把一级结构研究清楚之后，我们才 能研究生命过程中的许多复杂问题。
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（2）三价铁显色法： 含有色氨酸的样品，与铁离子的醋 酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈 玫瑰红色，在545nm比色测定。 此法测定简便、快速，线性关系较 好。但反应混合物中的含水量对显色有 一定影响。因此，不如对-二甲基氨基 苯甲醛法使用广泛。
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氨 基 端 的 分 析
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley 等1956年报告了丹磺酰氯与氨基酸、肽 或蛋白质的氨基反应产生黄色的荧光， 由此产生了测定N末端的新方法，称 DNS法。 本法测定N末端的原理与DNP法有 相似之处。但比DNP法的灵敏度提高了 100倍，使用更为广泛。
对氯汞苯甲酸与巯基反应， 形成巯基的对氯汞苯甲酸 衍生物（PCMB）。PCMB 最大吸收在233nm摩尔消光 值为1.96×104。与巯基形 成硫醇盐以后，增加到2.2 ×104从图中可以看出在 250nm处差值最大，这个差 值与参与反应的试剂量有 直接关系。测定时，用含 巯基化合物支滴定固定量 的汞试剂，直至吸收差值 不再增加为止，根据汞试 剂的量可以计算出巯基数 量。由于测定是在蛋白质 的吸收范围内进行，因此 必须作蛋白质含量对吸收 36 影响的校正。
第三章蛋白质一级结构的测定
不带电荷极性R基团氨基酸
O N HH2＋ 3N CH C CH2 CH2 C NH2 O OH O－
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
O H2N H3N＋ CH C CH2 C OH O
O－ OH
-氨基丁二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-氨基--羟基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine
不带电荷极性R基团氨基酸
O ‖ HH2＋ O－ 3N N－CH－C－OH │ CH2 │ SH
-氨基--巯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
包括以下几方面内容： ①多肽链的数目； ②每条多肽链中氨基 酸的种类、残基数目和 排列次序； ③链内或链间二硫键 的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证
测定的基本战略和步骤
特殊氨基酸的测定
蛋白质中氨基酸组成的表示方法
蛋白质营养价值的评价
1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构
组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为氨基酸，除甘氨酸外都是L-型。
不变部分
可变部分
2. 蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
非极性R基团氨基酸
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
第三章 蛋白质一级结构及测定
③Cleland试剂的还原作用
Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二 硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试 剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与 疏基乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。
还原蛋白不稳定，SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定 SH基的方法可用烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生 物。
它能选择性 地切割由甲 硫氨酸的羧 基所形成的 肽键
R1 O + HO -CH-C-N-CH-C=NH-CH-C~ 2 Br O H2C O CH2 + CH2-S-C N ¼»ÁÇË ×ùòèá R H O H 2O +-CH-C-N-CH-C O O H2C-CH2
R
H
R1 O H2N-CH-C~ C¶ ë ¶ NÄ ¶ ËÄÎ ©Ë
R1 R2 Rh H2N-CHCO~NH-CHCO~NH-CHCOOH R1 R2 õë £Â õë £Â £±¼È³Ìõ뻺Σ ¨½×©éá£Â¯Ïï© Î Ë NH2NH2 Þ® o 100 C 5~10h Rh
H2N-CH-CONHNH2+H2N CH CONHNH2+....+H2N-CH COOH
OH－ pH9 —
苯异硫氰酸酯 ( PITC ) S
=
②与Edman试剂反应的 产物为：苯乙内酰硫脲氨 基酸（PTH-氨基酸） ③PTH-氨基酸可用乙 酸乙酯抽提，再用纸层析 或薄层层析鉴定
S C
－NH－C－NHCHCO－NHCHCO —
苯氨基硫甲酰多肽 （氨基酸）
S－C C N H － —
R H+ O
测定蛋白质一级结构的方法
测定蛋白质一级结构的方法哇塞，蛋白质的一级结构可是非常重要的呀！那要怎么去测定它呢？
测定蛋白质一级结构的方法主要有以下这些哦。
首先是通过氨基酸组成分析，要把蛋白质水解成氨基酸，然后进行定量和定性分析，这就像拼图前要先知道有哪些拼图块一样。
这里面要注意水解的条件要控制好呀，不然会影响结果的准确性呢。
还有呀，不同的分析方法也要选对，不然也会出问题哟！
在这个过程中，安全性那可是相当重要的呀！得小心使用那些化学试剂，别一不小心伤到自己啦。
稳定性也得保证呀，每一步操作都要稳稳当当的，可不能马虎。
那它都有哪些应用场景和优势呢？这可多啦！比如在生物制药领域，了解蛋白质的一级结构可以帮助开发更有效的药物呢，就像有了精确的地图才能找到宝藏一样。
而且这种方法准确性高呀，能够给我们提供非常可靠的信息呢。
我给你说个实际案例吧。
比如说研究某种疾病相关的蛋白质，通过测定它的一级结构，科学家们就能更好地理解这个蛋白质的功能和作用机制，说不定就能找到治疗这种疾病的新方法呢！你说厉害不厉害？
总之呀，测定蛋白质一级结构的方法真的是超级重要的呀，它就像一把钥匙，能打开蛋白质奥秘的大门，让我们更好地了解生命的奥秘呢！。
蛋白质一级结构测定详解
蛋白质一级结构测定详解蛋白质一级结构测定是指确定蛋白质分子中氨基酸的序列顺序。
蛋白质的一级结构决定了蛋白质的功能和特性，因此准确测定蛋白质的一级结构对于理解蛋白质的功能和研究蛋白质的生理机制非常重要。
本文将详细介绍几种常用的蛋白质一级结构测定方法。
1.编码方法：蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学技术直接从DNA的序列中获取。
通过DNA的转录和翻译过程，蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学方法快速测定。
这种方法适用于已经测定过基因组的生物。
2.氨基酸分析法：氨基酸分析法是一种传统的蛋白质一级结构测定方法，通过将蛋白质水解成氨基酸，然后使用氨基酸分析仪来测定各种不同的氨基酸的含量和种类。
这种方法可以确定蛋白质中各种氨基酸的相对含量和比例，从而推断出蛋白质的氨基酸序列。
3.编码二维电泳：编码二维电泳是一种结合二维凝胶电泳和质谱技术的方法，可以用来测定蛋白质的一级结构。
首先，将蛋白质进行酶解，然后使用不同标记的肽酶消化蛋白质样品，并通过二维凝胶电泳将消化产物分离。
然后，将二维凝胶电泳的凝胶切割成片段，使用质谱仪进行质谱分析。
最后，根据质谱分析的结果确定蛋白质的氨基酸序列。
4.氨基酸测序法：氨基酸测序法是一种直接测定蛋白质氨基酸序列的方法，通过测定蛋白质中氨基酸的顺序，可以确定蛋白质的一级结构。
氨基酸测序法通常使用肽酶来酶解蛋白质，并使用街染色物质标记氨基酸。
然后，通过比色法或质谱仪等方法测定每个氨基酸的相对含量或精确质量，最终确定蛋白质的氨基酸序列。
综上所述，蛋白质一级结构测定方法有很多种。
不同的方法适用于不同的实验目的和条件。
选择合适的方法来测定蛋白质一级结构非常重要，可以提供宝贵的信息来理解蛋白质的功能和特性。
随着技术的不断发展，蛋白质一级结构测定的准确性也在不断提高，相信将来会有更多的方法被开发出来来解析蛋白质的一级结构。
蛋白质一级结构的测定方法
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3）氨基酸组成分析 酸水解
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸（磺酸）在 105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来 用4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应 用。
测定蛋白质的分子量
鉴定方法：
估算氨基酸残基数，确定肽
⑴ 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 链数
(PAGE)要求一条带，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶
⑵ DNS—Cl（二甲氨基萘磺 过滤法，沉降系数法
酰氯）法测N端氨基酸。
(3) 亲和层析
(4) western 印迹法等
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及测定的一般步骤
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（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法
羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根 据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。 应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学 实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放 出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
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羧肽酶法
第二节 蛋白质一级结构 的测定
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一、蛋白质一级结构定义(primary structure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行 排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称 为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。 核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包 括二硫键的位置。 意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋
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（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法
测定蛋白质一级结构的方法进展
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的序列，其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义，对生命科学的发展更是起到了推进作用，而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于：①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备；②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据；③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段， 再对肽段进行氨基酸 序列测定，其中化学法裂解的肽段一般较大，适于自动序列分析仪测定；酶法的优点是专一 性强，降解后肽段易纯化，产率较高，副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序，测 定方法主要是化学法，酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典，它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率，使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱（LC）HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体，粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的，现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好，且用样量少，并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
蛋白质一级结构的测定
蛋白质一级结构的测定主要包括以下几个步骤：
1. 多肽链的分离和降解：将纯化后的蛋白质分子进行分离，然后利用化学或酶解方法进行降解，得到小片段多肽。
2. 肽段的分离和序列分析：利用各种色谱和电泳技术对肽段进行分离纯化，然后使用质谱技术或其他化学方法进行序列分析。
3. 二硫键的定位：通过化学或酶解方法断裂二硫键，然后利用质谱或其他方法进行定位。
在测定过程中，需要注意保持蛋白质的纯度在97%以上，同时还需要对蛋白质的分子量进行测定。
常用的蛋白质一级结构测定方法包括蛋白质测序法、DNA 测序法以及质谱测序法等。
其中，质谱法将已知分子质量的纯化后的蛋白酶解为小片段多肽并进行序列分析，根据小肽段之间的重叠区确定小肽段的排列顺序，依此推演整条多肽链的氨基酸序列。
以上信息仅供参考，建议查阅专业的生物化学或分子生物学书籍获取更详细的信息。
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③二硫健的断裂及多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离 出来；
几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键 还原为巯基；
用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂 保护生成的巯基，防止其重新被氧化；
Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 • R1=Pro（抑制） • pH2.0
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嗜热菌蛋白酶（thermolysin)
➢ 特点：专一性较差 ➢ 断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏
水性强氨基酸残基的羧 基端肽键 • R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、
-OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化
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④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺 序的测定
用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱 水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析 仪测定； 测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反 应分析各肽段氨基酸顺序；
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
• 特点：专一性较强，水解速度快 • 断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 • R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R） • R2=Pro（抑制）
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糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）
O
O
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⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解
获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重 叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序； 确定多肽链中二硫键的位置。
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2、多肽链氨基酸顺序分析
• 多肽链降解必须满足两个条件： 选择性强、反应产率高 主要方法包括酶解法和化学法
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酶解法
某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的 某一类肽键；
A. 样品必需纯（>97%以上）； B. 知道蛋白质的分子量； C. 知道蛋白质由几个亚基组成； D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量
计算每种氨基酸的个数。 E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
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（2）蛋白质分子的一级结构测定方法
氨基酸组成分析 氨基酸末端分析 蛋白质中肽链的拆离 肽链的部分降解及肽片断的分离 肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠 二硫键与酰胺基的定位
第三章 蛋白质的一级结构的测定
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蛋白质氨基酸顺序的 测定是蛋白质化学研究 的基础。
自从1953年F.Sanger 测定了胰岛素的一级结 构以来，现在已经有上 千种不同蛋白质的一级 结构被测定。
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蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作
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（1）测定蛋白质的一级结构的要求
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
+
NH CH C NH CH C
H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
高丝氨酸内酯
+ H3N+
RO CH C
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（2）多肽链的末端氨基酸测定
N末端的测定
二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；异硫氰酸苯脂法（PITC 法）；
Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA 水解速度较快
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➢ 木瓜蛋白酶：
专一性差 断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感
➢ 葡萄球菌蛋白酶：
高专一性 断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键
——磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键 ——碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）
➢ 梭菌蛋白酶：
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
R3
水解位点
R4 肽链
• 特点：专一性稍弱，Leu、Met和His稍慢 • 断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基
酸残基的羧基端肽键 • R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA • R2=Pro（抑制）
如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。
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★巯基的保护
-OOC CHCH2 SH NH3+
O
C H2O C C l
-OOC CHCH2 SOCCH2
CH2Cl
NH3+
O
-OOC CHCH2 SCH2
O
NH3+
ICH2CNH2
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①测定蛋白质氨基酸残基组成
根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨 基酸的数量；
采用经典的阳离子交 换色谱分离、茚三酮 柱后衍生法，对蛋白 质水解液及各种游离 氨基酸的组分含量进 行分析。
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②测定蛋白质分子中多肽链的数目
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分 子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
高专一性 断裂位点：Arg残基的羧基端肽键
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化学法
溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
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溴化氰水解法(Cyanogen bromide)
---选择性地切割由Met羧基形成的肽键
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
水解速度与相邻AA性质精品有课件关: 酸性：-/碱性：+ 15
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
胃蛋白酶 Pepsin
• 特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱； • 断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸 • R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、
C末端的测定
羧肽酶法；硼氢化锂法；肼解法
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N末端的测定
N末端测定方法比较C末端更加成熟、可靠和准确，主要的 方法有：
主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热 菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；
糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；
胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮 氨酸、以及其他疏水性强
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胰蛋白酶（trypsi