pQE-30载体图谱及解析
人胰岛素的制备
⼈胰岛素的制备⼈胰岛素得制备⼀、获得⽬得基因从供体细胞中提取mRNA,以其为模板,在反转录酶得作⽤下,反转录合成胰岛素mRNA互补DNA,再以cDNA第⼀链为模板,在反转录酶或DNA聚合酶I得作⽤在,最终合成编码它得双链DNA序列。
即得到了⽬得基因。
反转录-聚合酶链反应法(⼀)从⼈体细胞内提取胰岛素基因转录得mRNA1, 细胞总RNA得提取 :取胰岛B细胞,⽤PBS洗后,加⼊TRIZOL试将细胞破裂,后⽤DEPC处理,多次离⼼后,取RNA⽩⾊沉淀,测OD值,电泳。
2 ,从总RNA中分离mRNA:取上述提取得总RNA若⼲,加⼊Buffer OBB ,Oligotex Suspension ,打匀。
70℃⽔浴(裂解RNA得⼆级结构), 20-30℃条件下,静置(让Oligotex与mRNA结合)。
将Oligotex/mRNA复合物得沉淀加到EP管SPIN柱上⾼速离⼼,加Buffer 将其她RNA洗脱,最后⽤琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
(⼆)mRNA转录合成cDNA第⼀链cone 第⼀链得合成加⼊上步获得得mRNA与适当引物于EP管中,加⼊RNase-free water,混匀后,70℃反应10分钟,反应完成后,⽴刻将反应体系置于冰上5min;稍微离⼼⼀下,顺序加⼊缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP(加⼊放射性同位素利于检验), 混匀,稍微离⼼反应物之后,42℃放置2分钟。
取出置于冰上。
电泳分析,同位素活性测定。
(三)PCR法扩增,特异合成⽬得cDNA链通过胰岛素得特异引物,⽤PCR法进⾏扩增,特异得合成胰岛素得cDNA 链。
PCR法得操作步骤:预变性引物退⽕引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物:5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac caccac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’后端引物:5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’⼆、组建重组质粒采⽤pQE--30质粒作为载体,⽤双酶切法进⾏基因重组。
pET-30a大肠杆菌表达载体,质粒,菌株
pET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株编码名称规格保存条件北京华越洋生物GHT-20MG pET-30a20mg-20℃,避光,12个月北京华越洋生物GHT-100mg pET-30a100mg-20℃,避光,12个月pET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株载体信息：启动子：T7/lac复制子：pBR322 oripET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株载体别名：pET-30a,pET30a,pET 30a载体分类：大肠杆菌表达载体载体大小：5422 bp载体抗性：卡那霉素Kan载体标签：N-His, N-S, N-Thrombin, N-EK, C-His筛选标记：克隆菌株：DH5α表达宿主：BL21 (DE3)培养条件：37℃,LB5' 测序引物:T7：TAATACGACTCACTATAGGG3' 测序引物:T7-Ter：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG备注：pET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株载体简介：The maps for pET-30b(+) and pET-30c(+) are the same as pET-30a(+) (shown) with the following exceptions: pET-30b(+) is a 5421bp plasmid; subtract 1bp from each site beyond BamH I at 198. pET-30c(+) is a 5423bp plasmid; add 1bp to each site beyond BamH I at 198. The pET-30a-c(+) vectors carry an N-terminal His•Tag®/thrombin/S•Tag™/enterokinase configuration plus an optional C-terminal His•Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below.操作说明：1.请使用华越洋生物定制开箱器打开外包装；2.该产品包含20μl质粒，可保存在-20℃冰箱中；3.取1μl质粒转化进合适的感受态中；4.大量提取质粒并保存适量的甘油菌，置于-80℃长期保藏；。
【国家自然科学基金】_pqe30_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140803
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
科研热词 原核表达 鲢(hypophthalmichthys molitrix) 重组质粒 载体构建 蛋白纯化 茎线虫 腺病毒 组织表达 甘薯 杂交籼稻 序列分析 实时定量rt-pcr 姊妹染色单体粘着蛋白 多克隆抗体 原核表达载体 克隆 五邻体 runx3基因 rt-pcr osrad21-i il-8 ibmips-1基因 hlx cdna克隆
推荐指数 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2011年 科研热词 推荐指数 靶向输送 1 表达 1 融合蛋白 1 精氨酸九聚体 1 原核表达 1 单链抗体 1 丙型肝炎病毒 1 pseudomonas koreensis jdm-2 1 p7蛋白 1 her2 1 acds基因 1 acc脱氨酶 1
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
科研热词 推荐指数 黑鲷(acanthopagrus schlegeli) 1 黏附蛋白 1 重组表达 1 表达 1 萤火虫荧光素酶 1 纯化 1 疫苗 1 生物活性 1 抗原性 1 原核表达 1 兔多杀性巴氏杆菌 1 免疫应答 1 克隆 1 佐剂 1 elr+cxc趋化因子 1 cpm36 1 asp-1 1
推荐指数 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定
ｏ ｃｅｐｅｓ ｎ ｖｃ ｒｐ Ｅ ０ ｈ Ｌ Ｉ ａ ｏｓ ｕｔ ｄ ｉｅｔ ｅ ． ｅｕｔ： ｌ ａ ｒ ｍ ｉａｔｖｃ ｒｐ Ｄ１ 一 ｈ Ｌ Ｉ ｄ ｉ ｔ ｘ ｒｓ ｏ ｅｔ Ｑ ３ 一 Ａ Ｒ Ｐ Ｗ ｃｎｔ ｃ ｄ ａ ｄｎｉ ｄ Ｒ ｓ ／ Ｃｏ ｌ ｅ ｂｎ ｎ ｅｔ Ｍ ８ Ａ ＲＰ ａ ｉ ｏ ｓ ｒ ｅ ｎ ｉ ｆ ｓ ｎ ｃ ｏ ｏ ｎ ｅｐｅｓ ｎ ｖｃ ｒｐ Ｅ ０ ｈ Ｌ Ｉ ｅｅｃｎｔ ｃ ｄ Ｎ ｅｕｎ ｅ ａａ ｓ ｄ ｒｓｉｔｎ ａａ ｓ ｈｗ ｄ ｂｔ ｆｔｅ ｖｃ ｒ ｘ ｒ ｉ ｅｔ Ｑ ３ 一 Ａ Ｒ Ｐ ｗ ｒ ｏ ｓｕ ｔ ．Ｄ Ａ ｓｑ ｅｃ ｎ ｌ ｉ ａ ｅｔｃｏ ｌ ｉ ｓｏ ｅ ｏ ｏ ｈ ｅｔ ｓ ｓｏ ｏ ｒ ｅ ｙ ｓｎ ｒ ｉ ｎ ｙｓ ｈ ｏ ｗ ｒ ｔｅｓｌｅａ ｈ ｒｄｃ ｄ ｒｓｌ．Ｃ ｎ ｌｓｏ Ｐｏａｙｔ ｘｒｓｉ ｅｔｒｐ Ｅ ０ ｈ Ｒ Ｐ ｉ ｓｃｅｓ ｌ ｏｓ ｕｔ ． ｅｅｈ ａｌ ｓ ｔ ｐｅ ｉｅ ｕｔ ｏ ｃ ｉｎ：ｒｋｒｏｃ ｅｐ ｓ ｎ ｖｃｏ Ｑ ３ 一 ＡＬ Ｉ ｓ ｕｃｓｆ ｌ ｃｎｔ ｃｅ ３ ｆ ｅ ｔ ｅ ｓ ｕ ｉ ｅ ｏ ｕｙ ｒ ｄ 【 ｅ ｏｄ 】Ｈ ｍ ｕｍｅｔ ｆｌ ｅ ｇｎｒｔｎ Ｐｏａｙｔ ｘｒｓｉ ：Ｑ ３ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｕ ａ ａｇ ｎ ｒｏ ｉ ｒｒ ｅｅａｏ ；ｒｋｒｏｉ ｅｐｅｓ ｎ ｐ Ｅ ０ ｎ ｅ ｖ ｅ ｉ ｃ ｏ
ＤＥ ｉｎ ｈ ａ ｅ ＮＧ Ｊａ ｃ ｕ ｎ．ｔ
（ ｅ ａｔ ｅ ｔｏ ｍ ｔ ｏｙ ｔｅＳ ｃｎ ｆ ｌｔｄ Ｈｏ ｉ ｌＣ ｏｇ ｉ ｄｃｌＵ ｉ ｒｉ ） Ｄ ｐ ｒ ｎ ｆ Ｈｅ ａｏ ｇ ， ｅｏ ｄ Ａｆ ｉ ｅ ｓ ｔ ， ｈ ｎｑｎ Ｍｅ ｉａ ｎ ｅｓ ｙ ｍ ｌ ｈ ｉ ａ ｐａ ｇ ｖ ｔ
N端和C端加his标签的利弊
1.在N末端加入标签
这一系列载体的N末端加有标签，其中pQE-30、pQE-9带有6×组氨酸标签，pQE30系列中的三个载体的多克隆位点距离其实密码子而个相差一个碱基，pQE-9则是在多克隆位点处的设计较简单。PQE40则是带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签（6×His-DHFR），对于比较难表达的蛋白以及蛋白太小容易被降解的蛋白可以利用这种标签。它可以保证蛋白的稳定性，同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响，非常适合用于表位筛选。
常用pGEX载体图谱
常用pGEX载体图谱Rosetta系列的表达菌株可以提供T7 RNA聚合酶，它能表达PET系列载体上的外源基因。
pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA 聚合酶，普通的大肠杆菌经IPTG诱导即可表达Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。
其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac 启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成蛋白标签：A myc tag is a polypeptide proteintag derived from the c-myc gene product that can be added to a proteinusing recombinant DNA technology. It can be used for affinity chromatography, then used to separate recombinant, overexpressed protein from wild type protein expressed by the host organism. Itcan also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits.A myc tag can be used in many different assays that require recognition byan antibody. If there is no antibody against the studied protein, adding a myc-tag allows one to follow the protein with an antibody against the Myc epitope. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence or detectionby Western blotting.The peptide sequence of the myc-tag is (in 1- and 3-letter codes, respectively):N-EQKLISEEDL-C,N-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu -C, where N stands for Amino-terminus and C stands for Carboxy terminus. The tag is approximately 1202 Daltons in atomic mass and has 10 amino acids.It can be fused to the C-terminus andthe N-terminus of a protein. It is advisablenot to fuse the tag directly behind the signal peptide of a secretory protein, since it can interfere with translocation intothe secretory pathway.A monoclonal antibody against themyc epitope, named 9E10, is available from the non-commercial Developmental Studies Hybridoma BankpGEX4T1载体基本信息出品公司: GE别名: pGEX-4T-1, pGEX4T1, pGEX 4T 1质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4969 bp5' 测序引物及序列: pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG3' 测序引物及序列: pGEX3': CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG载体标签: N-GST载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 复制子是pMB1产品目录号: 27-4580-01稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pGEX4T1载体质粒图谱和多克隆位点信息原核生物DNA复制起始点，是DNA链上独特的具有起始DNA复制功能的碱基序列。
构建的质粒
构建载体注意事项
1、双酶切时注意挑选的酶切位点，有时识别序列不一样的，酶，在酶切后会产生相同的粘性末端，给试验造成很大的麻烦；
2、注意两种酶工作条件的差异，尽量使用可以同时双酶切的两种酶；
3、在PCR产物末端引入酶切位点时，要注意在引物酶切位点的末端加入保护碱基；
4、PCR产物最好在沉淀之后再进行酶切，怡排除残存的Taq活性的影响；
5、酶切时要注意酶的星活性问题，要控制甘油含量在5％之内（酶中含有50％的甘油，所以加入酶的量不能超过反应体系的1/10）；
6、双酶切入单独进行时要注意酶切的先后顺序，有些酶在末端时酶切效果不好，这时应该先做这个酶切；
7、酶切后要加热（65度10min）使酶失活，有些酶则必须用酚氯仿抽提，切胶回收使比较好的方法；
8、连接使注意载体与片断的比例，一般为片断：载体3－5：1比较好，连接反应体系要小一些（5－10ul）；连接后可直接进行转化，但连接产物的比例不能超过感受态细胞的1/10为佳；
9、在连接时反应体系中氯化钠或氯化钾的浓度不要大于200mM，因为这回抑制ligase的活性；
10、在连接之后进行转化之前应在65度加热10min，这样可以提高转化效率，如是进行电机转化则应用酚氯仿进行抽提；
11、转化时要设对照怡确定转化的效率；。
人脂联素原核表达载体PQE30_ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达
天津医药2008年11月第36卷第11期脂联素（adiponectin，ADPN）是脂肪细胞特异性分泌的一种血浆激素蛋白，在循环血液中大量存在，约占人体血浆总蛋白含量的0.01％[1]。
人类脂联素基因定位于染色体3q27，全长约17kb，由3个外显子和2个内含子组成，编码244个氨基酸组成的胶原样蛋白。
大量研究证明脂联素在调节内分泌代谢及能量平衡过程中发挥了极其重要的作用，可降低血脂、血糖，改善胰岛素敏感性及拮抗动脉粥样硬化[2]。
在脂联素转基因小鼠中，脂联素的过度表达成为预防糖尿病和动脉粥样硬化的保护性因素，重组脂联素在动物模型中具有抑制内源性葡萄糖产生等作用[3]。
本研究成功构建PQE30/ADPN原核表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究脂联素信号传导机制及其生理作用奠定了基础。
1材料与方法1.1材料大肠杆菌JM109及M15均为本室储存；DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶，T4DNA连接酶为大连宝生物工程公司产品；质粒PUC57为上海生工生物技术公司产品；表达载体PQE30为Qiagen产品；PCR上、下游引物为本室设计，由上海生工生物技术公司合成及测序；兔抗人脂联素抗体购自Biovem公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG 为武汉博士德生物工程有限公司产品；DAB显色试剂盒购自北京天根生物技术公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2方法1.2.1人脂肪组织总RNA提取及脂联素cDNA的克隆参考文献[4]。
人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达*史晓文刘德敏孙颖张捷摘要目的：构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN，并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白，对表达产物进行鉴定。
方法：将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。
通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ ADPN，并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。