维真生物-如何阅读基因载体图谱
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
☆如何阅读质粒图谱
如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素#复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l＃P/E 启动子/增强子l＃Termsl 终止信号＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
维真生物-如何阅读基因载体图谱
如何阅读基因载体图谱1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。
可发生于完整活体或是细胞培养中。
可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。
用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：（1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表达；（3）对人体不致病；（4）在环境中不会引起增殖和传播。
非病毒载体一般是指质粒DNA。
2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。
3、按功能分类：克隆载体、表达载体克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。
表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。
1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。
Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。
2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
（5）hygr：使潮霉素β失活。
3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
还要再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
利用addgene查找质粒图谱
利用addgene查找质粒载体图谱生物工程杨翔2012718026 摘要：现如今的生物实验研究中，细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
在天然质粒的基础上，为了适应实验室操作而进行人工构建质粒载体。
与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点（MCS）序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
做分子实验，经常和不同的质粒打交道，了解各种质粒的图谱信息是必需的，然而如何准确迅速的查找到所需要的质粒图谱，是实验研究的基础工作，这里简单介绍一下应用addgene网站查找质粒图谱的方法。
关键词：质粒图谱，addgene一．Addgene简介Addgenen是一个全球科学家质粒共享非盈利组织。
它作为一个公益性组织，负责保存和提供质粒。
科学家发表文章如果涉及到质粒，会发一份到Addgene保存，其他科学家如果需要这个质粒，也可以向Addgene索取二．网站首页界面/点击此网址，进入addgene首页，可以看到如下界面。
菜单栏包括了：Home（首页），Deposit Plasmids（储存质粒），Find Plasmids（查找质粒），How to Order（如何构建），Plasmid Reference（质粒引用）以及最后一个About Addgene（关于Addgene）三．查找方法1.我们以常见的pRS质粒为列，点击菜单栏的Plasmid Reference，进入以下界面。
2.再点击下图中的Vector Batabase，进入载体数据库。
点击后会出现以下界面3.之后，我们可以根据界面中给出的四种搜素方法查找所需的质粒载体，包括：Plasmid Type（质粒类型）Source（质粒的来源）Bacterial Resistance（细菌抗药性）Selectable Marker（选择标记）我们也可以直接在搜索框中输入所需查找的质粒，如以pRS为列。
如何阅读质粒图谱与载体构建
1) 复制起始位点 Oril 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始
点。而
真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
2) 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+l ,Kan+
3) 多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l
4) P/E 启动子/增强子 lΒιβλιοθήκη 5) Termsl 终止信号
2. 载体的分类 ＃按功能分成： （1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用 来克隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是 使用的严谨型载体） （2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的 DNA 顺序的载体。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针？ 那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，而 它的抗性基因在另一条链上.
三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写） 1. 什么是载体 即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受 体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载 体（vector）。 P.S.基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 ＃启动子－促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游， 是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
igv可视化转录本结构
igv可视化转录本结构
IGV（Integrative Genomics Viewer）是一个用于交互式查看和分析大规模基因组数据的开源软件。
它可以用于可视化基因组测序数据，如全基因组测序（WGS）、外显子组测序（WES）和RNA测序（RNA-seq）等。
在IGV中，可以使用不同的可视化工具来查看和分析转录本结构，包括基因注释、基因表达量、基因变异等。
要使用IGV可视化转录本结构，需要先下载并安装IGV软件，并准备相应的基因组和转录本数据。
以下是一些常用的步骤：
1. 打开IGV软件，选择合适的基因组数据和转录本数据。
2. 在基因组浏览器中，选择“Track”菜单，添加相应的转录本数据。
3. 根据需要调整转录本数据的显示方式，例如颜色、高度和标签等。
4. 可以使用鼠标滚轮或缩放工具来放大或缩小基因组区域，以便更好地查看转录本结构。
5. 在查看转录本结构时，可以使用IGV的搜索功能来查找特定的基因或转录本。
6. 可以将IGV中的可视化结果导出为图片或保存为项目文件，以便在其他地方使用。
总之，使用IGV可视化转录本结构可以帮助研究人员更好地了解基因表达和变异情况，从而为生物医学研究提供有价值的线索。
实验新人必读（七）：一文学会读懂和查找质粒图谱
实验新⼈必读（七）：⼀⽂学会读懂和查找质粒图谱作者：解螺旋.⼦⾮鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医⽣科研助⼿导语质粒图谱即为质粒DNA序列的物理图谱，包含了质粒⼤⼩、筛选标记、克隆位点、转录及翻译元件等信息。
尽管它为我们选择质粒、了解质粒特点及应⽤提供了重要依据，然⽽我们常常要为图谱中丰富信息所困扰。
那么，本⽂就为你拨云见⽇，让你快速掌握质粒图谱。
三步法看懂质粒图谱Step 1:先了解质粒的基本组成元素。
1）复制起始点Ori。
该位点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，它是质粒中⼀段特定序列，富含AT和重复序列。
Tips：图谱上只有⼀个Ori，表⽰质粒是原核克隆表达质粒；有两个Ori，则表⽰该质粒是，穿梭质粒，即可在原核也可在真核中复制。
2）抗性筛选基因。
图谱中Kan/tet就是抗⽣素抗性基因，⽅便后续通过抗⽣素筛选阳性克隆。
特点就是单词最后会以⼤写R或上标r结束。
Tips：⼀般克隆载体只有⼀种抗性筛选标记，部分表达载体及穿梭质粒具有两种抗性筛选标记。
3）多克隆位点（MCS），即⼀系列限制性内切酶酶切位点，是外源DNA插⼊位点，⼀般可通过酶切/连接⽅式将外源DNA插⼊质粒，外源DNA⼀般⼩于10kb，⽽⽚段越长，转化效率越低。
Tips: ⼀般位于转录启动和转录终⽌信号之间；所包含的限制性内切酶位点数量和组成因载体不同会有所差异，且其中的酶切位点在质粒中为单⼀的酶切位点；同时在使⽤时需注意质粒载体与外源DNA酶切位点的兼容性问题4）荧光标记或蛋⽩标签序列。
蛋⽩纯化标签蛋⽩：His-Tag，GST-Tag等；蛋⽩检测标签蛋⽩：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Tag等；荧光蛋⽩表达标签：GFP，mCherry等。
Step 2:看质粒是否是表达载体，如果是，那就必定有这些原件：启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号。
1、启动⼦：促进DNA转录的DNA序列，可与RNApol特异性结合。
2、增强⼦/沉默⼦：前者是真核基因组中⼀种增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作⽤与增强⼦所在位置或⽅向⽆关。
质粒图谱怎么看
一、质粒（plasmid）：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
载体（Vector）：简单的来说就是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体，分为病毒类和非病毒类两种。
我们平时常说的载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的，通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作，同时加入一些多用途的辅助序列。
二、如何阅读质粒图谱看懂一个质粒图谱我们需要关注以下几点：1）弄清楚质粒的方向看质粒图谱的时候我们会发现大多数质粒都会有顺时针和逆时针两个方向的箭头，箭头的方向：一个方向是复制起始位点的方向，即该质粒在细菌或真菌中DNA复制的一个方向，有时图谱中还会有f1 ori，这个代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，但是可以用来测序。
另一个就是转录方向（一般是正向），主要是从启动子开始，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。
2）复制子复制子又称复制起始区，它控制着质粒DNA的复制，并决定了质粒的宿主和拷贝数。
复制子可分为严谨型复制子与松弛型复制子，分别对应低拷贝数的严紧型质粒和高拷贝数的松弛型质粒。
3）筛选标记：了解筛选标记类型（如抗生素抗性标记），方便后续确定筛选重组质粒载体。
常见抗菌素抗性标记有氨苄青霉素抗性（Amp）、卡那霉素抗性（Kan）、四环素抗性（Tet）、链霉素抗性（Str）、氯霉素（Cmr, 某些酵母表达质粒）、潮霉素（Hyg, 农杆菌里常用的）。
4）多克隆位点MCS区：既外源基因的插入位点。
具有多个限制酶酶切位点，外源性的DNA一般可通过酶切/连接的方式插入质粒。
）其他元件，如表达系统元件和蛋白标签等常见的启动子有：CMV、EF1（常规表达，一般启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），CAMV35S、Ubi（植物表达常用），T7（常用原核系统表达启动子）。
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如何阅读基因载体图谱1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。
可发生于完整活体或是细胞培养中。
可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。
用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：（1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表达；（3）对人体不致病；（4）在环境中不会引起增殖和传播。
非病毒载体一般是指质粒DNA。
2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。
3、按功能分类：克隆载体、表达载体克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。
表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。
1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。
Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。
2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
（5）hygr：使潮霉素β失活。
3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
还要再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
4、P/E：启动子/增强子5、Terms：终止信号6、加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用示例阅读载体：pENTER载体1）human ORF + pENTER载体2） CMV启动子，T7启动子3） ORF的C端融合了Flag和His tag4) 多克隆位点，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)4） SV40 poly（A）加尾信号5） SV40启动子启动的puro标记6） 2个腺病毒ITR序列和2个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将ORF序列同源重组到腺病毒载体，直接用于腺病毒的生产。
慢病毒载体1）EF1a启动目的基因（可添加小标签FLAG或HIS等小标签）2）CMV启动GFP，非融合抗性筛选标记Puro（便于做细胞株的稳筛）3）WPRE（来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件），放置在目的基因的上游，能加强转基因的表达4) cPPT（来自HIV-1整合酶基因），增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度5）第三代慢病毒载体，载体中还包含HIV-1基因组中的顺式调节元件(ψ包装信号和LTR 长末端重复序列，其中3’LTR增强子功能缺失，5’LTR中U3区替代为CMV，更加安全的病毒载体)腺相关病毒载体AAV表达载体包括了中两个ITR + CMV（可替换其他组织特异性启动子，见改造载体部分）+ globin intron 内含子序列 + 目的基因 + poly A序列二、选择和准备载体选择载体主要依据构建的目的，同时还要考虑载体中应有合适的限制酶切位点等。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
选用哪种载体，还是要结合目的基因及载体特点以实验目的为准绳。
载体选择主要考虑下述3点：1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
2、载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小（大选大，小选小）。
尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。
①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。
目前，我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。
②慢病毒的包装容量约为6kb（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。
此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包装可能会有一定难度。
③AAV的总包装容量是4.7 kb（包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb），所以插入目的基因一般约2kb 左右。
由于AAV包装容量有限，目的基因大于2kb，可考虑去除内含子，因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。
（2）确定表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。
一般分为原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。
这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。
真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，只需要将它放到细胞或体内细胞即可，唯一考虑的是它的启动子的选择，常用都是cmv启动子的，表达效率较高，也有多种启动子经过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。
3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位。
①选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个；③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。
选择载体还需注意：无标签载体，起始/终止密码子都要添加！标签在N端的载体，终止密码子要添加！标签在C端的载体，起始密码子要添加！（详细解读如下）①对于无起始密码子和终止密码子的基因，插入无标签的载体要加入起始密码子和终止密码子。
②载体N端有标签，上游引物要对读码框；下游引物要加终止密码子(为了保证基因的表达,少翻译载体序列) 。
链接：对读码框是为了防止移码，是不是移码要看载体图谱，看酶切位点。
从ATG开始，要保证三个碱基编码的氨基酸不能影响插入目的基因的正常编码，若影响了插入目的基因的正常编码就要在设计引物的时候在酶切位点前或者后插入一个或者两个碱基，总之是不能影响插入目的基因的正常编码蛋白。
有的酶切位点含有起始密码子，如果标签在C端像Nco I就有一个ATG，这时候需要加碱基在酶切位点后面。
③载体C端有标签，上游引物要加起始密码子，且考虑是否加Kozak序列（真核表达系统）；下游引物要对读码框，并且要去掉基因本身的终止密码子（保证C端标签表达）。
链接：Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC （常见的序列是GCCACC），位于起始密码子（ATG）之前。
它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。
在真核生物中，该序列相对比较保守。
对应于原核生物的SD序列（原核基因在mRNA5’端起始密码子AUG上游一段对mRNA的翻译起作用的序列）。
添加Kozak序列的好处：核糖体需要Kozak序列进行稳定结合有助于提高真核基因的转录和翻译的效率。
1、改造启动子：一般在过表达载体中CMV属于广谱型的强启动子，具体可根据实验需求，选用不同启动子，尤其是对于AAV载体构建时选用组织特异性启动子。
2、实验目的的需要：①构建过表达or干扰载体根据实验用途选择载体，如过表达载体通常选用CMV启动子，CMV因其集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，是公认的真核表达中的增强子，一般插入某个基因的CDS区到CMV启动子下游，CMV负责启动该基因的表达，从而达到调高该基因表达的作用；而U6和H1更多的是用于shRNA的启动来达到敲低一个基因的作用，U6和H1启动子都是RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达约21个核苷酸和约50个核苷酸茎环结构（stem loop），RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，当RNA聚合酶Ⅲ到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止。
我们公司的shRNA病毒载体（包括腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体）是由U6或H1 启动shRNA 实现，并连接了报告基因，可以实时监测载体的转染效率。
构建干扰载体针对目的基因（目的基因需要大于0.7kb，若小于0.7kb需要评估来确保能设计出8条shRNA序列），设计并提供4个针对靶基因的shRNA产品，确保4个shRNA中的1个产品在细胞感染效率达80%以上的前提下，在mRNA水平至少有70%的沉默效果；也可以按照客户的要求来设计，由客户确定shRNA 序列的长度，对于每条选定的靶序列，设计正义链和反义链，以 loop茎环结构相连，合成shRNA。
②是否携带GFP等荧光标签携带荧光标签基本目的是为了观察感染目的细胞的效率；携带该标签的好处之一是不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达及定位情况，而且荧光性质稳定。
但是，由于GFP标签比较大（约720bp），这种大标签在位置上对目的基因造成了空间位阻作用，对蛋白的空间结构产生一定影响，从而不利于目的基因蛋白本身的活性及正常功能的发挥。
此外，还需要结合蛋白本身的特性，比如该蛋白为具有切割活性的蛋白，即使融合了GFP，标签很有可能会被破坏，终究会影响GFP的荧光及基本功能。
一般不建议融合这么大的标签，实验需要带荧光标签，建议构建载体时通过P2A非融合。
③是否融合6×His、HA、Myc、FLAG等小标签为了做免疫共沉淀实验或者WB检测蛋白表达,需要加融合小标签。
多数情况下,由于多肽标签相对较小，对目的蛋白质结构影响小。
但是在蛋白合成肽链的过程中，如果影响了蛋白的折叠，也会造成目的蛋白活性的下降甚至功能的丧失。
④是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
链接：启动子：促进DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操纵子编码区的上游，是DNA 分子上可以与RNA聚合酶特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
增强子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作用与其所在的位置或方向无关。