总糖含量的测定—3, 5-二硝基水杨酸法
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法。
本文将介绍该方法的操作步骤、原理及注意事项。
一、操作步骤1. 样品制备：精确称取适量糖样品，加入足量去离子水稀释至1 mL，摇匀。
2. 试剂制备：(1) Na2CO3试液：称取0.5 g Na2CO3加入50 mL去离子水中，溶解并稀释至1 L。
(2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)重量浓度为1 g/L的甲醛溶液：按比例称取适量DNS和甲醛，在去离子水中稀释制成重量浓度为1 g/L的甲醛溶液。
3. 测定步骤：(1) 取3个试管，编号为A、B、C，并进行空白对照。
将A、B、C试管分别加入0.1 mL 样品，每个试管中加入相同量的0.9 mL去离子水。
在空白试管中加入相同量的去离子水代替样品。
(2) 在A试管中加入0.5 mL Na2CO3试液，摇匀。
(3) 将B试管浸于沸水中加热3-5分钟，使其中的还原糖完全还原。
(4) 在A、B两样品试管中加入0.5 mL甲醛溶液，摇匀并置于60℃水浴上加热10分钟。
(6) 加入1.5 mL水后，在空白对照试管和样品试管中均加入0.5 mL DNS溶液，摇匀。
(7) 在95℃水浴加热10分钟，并立即冷却至室温。
(8) 测量吸光度值，通过标准曲线计算样品中还原糖或总糖含量。
二、原理还原糖或总糖与Na2CO3在典型的碱性条件下发生醛基反应，把碳水化合物中的亲电基转化为醛基，再将其还原为对应的醇，生成糖醇和尿素等。
然后，在碱性条件下，醛基与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应，发生环化，生成糖醛酸化合物，这些化合物在pH9.0以下表现为桥形分子，具有紫色的吸收峰。
在高温条件下，DNS与糖醛酸化合物相结合，形成柿子色化合物，进一步增加吸收光的强度。
还原糖或总糖的含量可以通过比较样品的吸光度值和标准曲线来测定。
三、注意事项1. 避免试管附着并确保试管内部表面干净。
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量3,5-二硝基水杨酸法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法，其原理基于还原糖在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物，而总糖则在强硫酸存在下加热分解，生成由葡萄糖和六碳糖等组成的还原糖，在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物。
具体操作步骤如下：1. 取一定质量的山楂片粉末，加入适量的蒸馏水，加热水浴至沸腾，过滤，将过滤液冷却至室温。
2. 取0.2 ml 过滤液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
3. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，还原糖含量的计算公式为：还原糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
4. 取剩余过滤液，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，浸于沸水中煮2小时，浸于水中冷却，并用蒸馏水将瓶口水洗入容量瓶，摇匀。
5. 取0.1ml 还原糖水样稀释液加入容量瓶，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，摇匀后加入适量的蒸馏水到刻度线，摇匀后离心。
6. 取0.1 ml 离心上清液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
7. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，总糖含量的计算公式为：总糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
总之，3,5-二硝基水杨酸法是一种稳定可靠的方法，能够准确测定山楂片中的还原糖和总糖含量，为山楂片的质量控制提供了重要的参考。
实验二十还原糖和总糖含量的测定—35-二硝基水杨酸比色定糖法
实验二十还原糖和总糖含量的测定—3、5-二硝基水杨酸比色定糖法目的要求1、掌握3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。
2、用3，5-二硝基水杨酸定糖法测定山芋粉中的总糖及还原糖。
3、熟悉721型光电比色计的原理及使用方法。
实验原理3，5-二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。
试剂和器材1.试剂（1）6mol/L盐酸溶液、10%氢氧化钠溶液、碘化钾-碘溶液（碘试剂）、酚酞指示剂、85%乙醇。
（2）3，5-二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：甲液——溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠中，并稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。
乙液——称取255g酒石酸钾钠，加到300ml 10%氢氧化钠中，再加入880ml 1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。
将甲液与乙液相混合即得到黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7～10d以后使用。
（3）0.2%葡萄糖标准液：准确称取200mg分析纯的葡萄糖（预先在70℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用。
2.器材试管和试管架、碱滴定管（50ml）、铁架台、滴定管夹、移液管（1ml，2ml）、移液管架、容量瓶（100ml）、铜水浴锅、玻璃漏斗、烧杯、铁三脚架、量筒（10ml、100ml）、电热恒温水浴、煤气灯、玻璃棒、白瓷板、721型分光光度计。
操作方法1.葡萄糖标准曲线的制定取9支刻度试管（25ml）或血糖管，分别按下表顺序加入各种试剂：DNS试剂1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5（ml）加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水（ml）21.5 21.5 21.521.521.521.521.521.5 21.5 将上述各管溶液混匀后，在721型分光光度计上进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值,以葡萄糖浓度为横座标，光密度值为纵座标绘制出标准曲线。
3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量
实验五 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量一：目的了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理 掌握总糖定量测定的操作方法 二：原理还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。
它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。
遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。
黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm 处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。
对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。
再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。
由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以COOHOHNO 2O 2N 还原糖COOHOHO 2N NH 23,5-二硝基水杨酸（黄色）3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）C C H O OH OH C H C H 2OH OH( )n ( )n C H C OH OHC H H 2OH OH糖酸折算系数（1-18018= 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。
三：实验材料及设备 1、材料：面粉2、仪器：分光光度计 电子天平 沸水浴3、器材：刻度试管： 25mL ×8 容 量 瓶： 100mL ×2 锥 形 瓶： 100mL ×1移 液 管： 1mL ×2 2mL ×2 10mL ×2 烧 杯： 250mL ×1 50mL ×1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 滤 纸： 11cm 坐 标 纸漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1 四：试剂的配制1、葡萄糖标准液（1mg/mL ）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法实验_百替生物
碳水化合物
实验一 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原
糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶
实验二 还原糖含量测定——砷钼酸比色法
一、目的 植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳 水化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此外，水果、蔬菜中含糖 量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。 因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。
ser v ice@
A、4％CuSO4•5H2O B、称取 24g 无水碳酸钠，用 850mL 水溶于大烧杯中，加入 2g 含 4 分子结晶水的酒石酸钾钠，待 全溶（应加热）后加入碳酸氢钠 16g，再加入 120g 无水硫酸钠（加热），全溶及冷却后加水至 900mL， 沉淀 1～2d，取上清液（要求严格时过滤）备用。 使用前将 A 与 B 按 1∶9 混匀即可使用。 （2）砷钼酸试剂：25g 钼酸铵 ( NH4)6Mo7O24·4H2O 溶于 450mL 蒸馏水中（加热溶解，但温度 接近 150℃时易分解），待冷却后再加入 21mL 浓 H2SO4 混匀。另将 3g 砷酸氢二钠(Na2HasO4·7H2O) 溶解于 25mL 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期使用。 （3）200μg／mL 标准葡萄糖原液：准确称取分析纯葡萄糖 200mg，溶解定容到 1000mL。
实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
总糖和还原糖的测定─3,5-二硝基水杨酸法思考题
总糖和还原糖的测定─3,5-二硝基水杨酸法思考题
1.为什么3,5-二硝基水杨酸法能够测定总糖和还原糖？
答：3,5-二硝基水杨酸法是一种常用的测定还原糖和总糖的方法，其
原理是将还原糖还原成相应的葡萄糖，在酸性条件下，葡萄糖与3,5-二
硝基水杨酸反应生成黄色化合物，通过比色法测定吸光度，即可计算出样
品中还原糖的含量。
同时，总糖中还包括非还原糖，这些非还原糖无法被3,5-二硝基水杨酸还原成葡萄糖，因此测得的是总糖含量，再用还原糖含
量去减即可计算出非还原糖含量。
2.3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖会受到哪些因素的影响？
答：3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖会受到以下因素的影响：
（1）反应时间：反应时间过短会导致还原糖没有充分被还原为葡萄糖，反应时间过长则会使吸光度值趋于平台，使测定结果不准确。
（2）反应温度：反应温度过高则会使试剂发生非特异性反应，导致
误差增大；反应温度过低则会使反应速率降低，反应不充分，测定结果不
准确。
（3）试剂的浓度：试剂浓度过高或过低均会影响反应结果的准确性，因此应当根据样品的含量调整试剂浓度。
（4）样品颜色：样品的颜色会影响吸光度的测定结果，因此应将样
品与试剂充分混合并进行比色。
（5）其他因素：例如样品中存在着色物质、杂质等都会影响到反应
的准确性。
DNS法测定发酵液中总糖含量
DNS法测定发酵液中总糖含量3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
DNS试剂的配方（3，5-二硝基水杨酸试剂）：称取酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH 2.1g（先配成溶液），苯酚0.5g，无水亚硫酸钠0.5 g, 搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存。
0.1％葡萄糖标准液：准确称取100 mg分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100 ml，冰箱保存备用。
注意事项：1. 在配制的过程中，如果操作不合理，会出现溶液变黑，或者有鸡蛋花一样的絮状沉淀出现。
2.称取DNS（具体重量，按照你的配方来，下同），加水溶解，水浴45℃；3.逐步加入氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；（a.药品中的氢氧化钠要配制成溶液；直接加颗粒，可能产生鸡蛋花；b.加入氢氧化钠溶液时，溶液的温度会上升，所以要慢慢加，不停地搅拌，同时溶液的温度不能超过48度；温度高了，溶液颜色变黑。
）4. 逐步加入四水酒石酸钾钠、苯酚和无水亚硫酸钠；（顺序最好不要更改！）5.继续45度水浴，同时补水，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；（一定要有耐心地搅拌！）6. 停止加热，冷却至室温，用水定容。
7. 储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后使用。
有效期为6个月。
（时间不忙的话，最好按照时间来操作，时间紧迫了，时间提前个几天，推后几天，也可以用的）【操作方法】一、葡萄糖标准曲线的绘制取9支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：将上述各管溶液混匀后，用72型分光光度计（520nm）进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。
以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
总糖含量的测定——3, 5-二硝基水杨酸法
原理：在氢氧化钠或丙三醇的的存在下, 还原糖能将3, 5-二硝基水杨酸(DNS) 中的硝基还原成氨基, 生成氨基化合物, 此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色。
试剂：葡萄糖;3, 5-二硝基水杨酸(化学纯) ;酒石酸钾钠、苯酚、盐酸、氢氧化钠、无水亚硫酸钠(均为分析纯);超纯水。
仪器和设备：紫外可见分光光度计；电子天平（感量为0.0001g）；电热鼓风干燥箱；电热恒温水浴锅。
溶液的配制
（1）DNS试剂的配制：称取18.2 g酒石酸钾钠、0.63 g3，5-二硝基水杨酸、2.1 g Na OH、0.5 g苯酚、0.5 g无水Na2SO3，分别加少量超纯水溶解，将酒石酸钾钠溶液放于45℃水浴锅，然后依次加入上述溶解好的试剂，边加边搅拌，取出后冷却至室温，加超纯水定容至100 m L，贮存于棕色瓶内，暗处保存，一周后使用。
（2）葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖置于105℃中干燥至恒重，精密称取0.100g 葡萄糖于100mL烧杯中，加水溶解，定容至1000mL，即得浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。
样品溶液的制备：准确称取样品0.2g～1.0g，精确到0.0001g，于50 mL试管中，加入20 m L蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤入100 mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度，即为样品测定液。
标准曲线的制作：
精密量取0.1mg/mL的葡萄糖标溶液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL 置于25mL具塞比色管中，加入蒸馏水补充至2.0mL。
向试液中分别加入3 mL DNS显色剂，于沸水浴中加热9 min，立即冷却至室温，定容至刻度，显色20 min后于波长540 nm处，用可见分光光度计测定不同浓度葡萄糖混合溶液的吸光度，并以葡萄糖质量浓度 (x)为横坐标，吸光度 (y)为纵坐标，绘制葡萄糖溶液标准曲线。
比色测定：吸取1.00mL样品测定液于25mL比色管中，向试液中分别加入3 mL DNS 显色剂，于沸水浴中加热9 min，立即冷却至室温，定容至刻度，显色20 min后于波长540 nm处，用可见分光光度计测定不同浓度葡萄糖混合溶样品溶液的吸光度，每个样品重复3次，取平均值。
样品中总糖含量，按式（3）进行计算
(3)
式中：
X3——样品中总糖含量（以葡萄糖计），单位以克每百克（g/100g）；
C——从标准曲线上查得样品测定液中葡萄糖的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL ）；
V1——样品定容体积，单位为毫升（mL）；
V2——比色测定时所移取样品测定液的体积，单位为毫升（mL）；
m——样品的质量，单位为克（g）；
0.9——以葡萄糖计算总糖含量的换算系数。
[1]杨宁, 王伟明, 姚琳, 董坤. 3,5-二硝基水杨酸法测定发酵型果露酒中总糖含量[J]. 中国酿造, 2018, 37(01): 181-184.。