花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定

1. 4.3 染色体计数 取供、受体亲本和杂种再生植株的根尖, 用饱和对二氯 苯预处理 2－3小时后, 卡诺溶液(冰醋酸: 乙醇＝1: 3)固
应体积为10 µL, 其中10×反应缓冲液1.0 µL, 10 mmol.
L－1 dNTP s 0. 25 µL, 2.5 U Taq 酶 (购自 Tian Gen 公 司) 0.6 µL, 100 ng模板DNA, 正向和反向引物各50 ng, 3. 4 µL ddH2O, 20 µL 矿物油覆盖。采用的 P CR 仪同 上, 扩增程序为: 94°C 5 分钟; 94°C 1 分钟, 35°C 1 分 钟, 72°C 1 分钟, 5 个循环; 94°C 1 分钟, 50°C 1 分钟, 72°C 1 分钟, 35 个循环; 72°C 10分钟, 4°C 保存。PCR 产物采用6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, Na2CO3银 染法染色显影, 在 X 胶片观察灯上观察并分析条带。
大量元素, 微量元素和有机成分; 包含 150 m .g L－1 水解 酪蛋白, 30 000 m .g L－1 蔗糖, 0. 5 mg.L－1 2, 4- 二氯苯 氧乙酸, 0. 2 mg.L－1萘乙酸, 0.2 m .g L－1 6-苄氨基嘌呤, 10 000 mg.L－1琼脂, pH 5. 8－6. 0), 促使愈伤组织形成,
收稿日期: 2007-03- 02; 接受日期: 2007- 06- 08 基金项目: 北京市自然科学基金(No. 5073045)、北京市自然科学基金重大项目(No.5050001) 和北京市科技创新能力建设项目 * 通讯作者。E-mail: liufan@nerc
张丽等: 花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定 177
1. 4.1.1 RAP D 分析 从 50 条随机引物中筛选出编号为 12 的随机引物, 在花 椰菜及黑芥双亲中表现出DNA的扩增差异, 用于对杂种 植株进行鉴定 。引物(由北京赛百盛基因技术公司合成) 序列为: 5'-GGGCCACTCA-3'。PCR 反应体系为: 总反 应体积 13. 5 µL, 其中 10×反应缓冲液 1. 25 µL, 2. 5 mmol ·L－1 dNTP s 1 µL, 2. 5 U Taq酶 (购自TianGen公 司) 0. 4 µL, 模板 DNA 100 ng, 随机引物 10 pmol, ddH2O 6. 85 µL, 20 µL 矿物油覆盖。PCR 反应在 Gene Amp 公司的 Sy stem 9600 PCR 仪上进行, 反应循环条 件参照姚星伟等(200 5)的方法。
摘要 利用非对称体细胞杂交技术, 获得芸薹属花椰菜(Brassica ol era cea var. b o tryti s)与黑芥(B. ni gra)的种间杂种, 实现 了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体, 具有抗黑腐、 黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体, 用不同强度的UV射线处理后, 利用PEG方法诱导供、受体原生质 体融合。培养后获得1 70 棵再生植株, 选取来自4 0 个不同愈伤组织的4 0 棵单株进行形态学观察及RAPD 和SR AP分子标记检 测, 结果表明其中30 棵为体细胞杂种。染色体计数显示, 约23 %杂种植株的染色体数目小于供 、受体染色体数之和 。用流式 细胞仪测定DN A含量显示, 杂种植株DN A含量是受体的2－4倍, 20 %杂种植株D NA含量小于供、受体之和。
植物学通报 Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (2): 176－184, w w w
.研究论文.
花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定
张丽 1,2, 赵泓 2 , 陈斌 2 , 刘凡 2 *
1 首都师范大学生命科学学院, 北京 100037; 2 北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100097
养基大量元素、微量元素和有机成分; 包含 150 mg. L－1 水解酪蛋白, 875 mg.L－1二水合氯化钙, 45 500 mg. . . L－1 山梨醇,45 500 mg L－1 甘露醇, 2 500 mg L－1 葡萄 糖, 125 mg.L－1 2- 脱氧 - 核糖, 0. 5 mg.L－1 2, 4- 二氯苯 氧乙酸, 0.2 mg.L－1 萘乙酸, 0.2 mg.L－1 6- 苄氨基嘌
关键词 非对称体细胞杂交, 黑芥, 花椰菜, 杂种鉴定, 植株再生 张丽, 赵泓, 陈斌, 刘凡 ( 2008). 花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定. 植物学通报 25, 176－184.
花椰菜(Bras sic a oleracea var. botrytis)为十字花 科芸薹属甘蓝的一个变种, 是具有较高营养价值及经济 价值的重要蔬菜, 但其生产常受到多种病害影响 。针对 蔬菜高效、安全生产的要求, 迫切需要抗多种病害的育 种材料。同时由于病菌小种的多样性和易变性, 也急需 进一步扩大育种材料抗病基因的多态性。例如危害甘 蓝类蔬菜的主要病菌之一— — 黑腐病菌, 现已鉴定出至 少 6 个生理小种(Vicent e et al., 2001), 但目前甘蓝中 普遍存在的是对小种 3 的抗性基因。在一些野生十字花 科植物中存在对主要生理小种 1 和 4 的抗性基因 (V ic ente et al., 2002)。由于生殖隔离, 利用常规杂交 育种难以实现优异基因的种间转移 。体细胞杂交为获 得种间杂种提供了可能性, 其中非对称体细胞杂交技术 是通过运用射线处理供体原生质体, 导致供体基因组的 有限转移, 有利于提高杂种育性, 缩短育种周期 (Forsberg et al. ,1998; Liu et al. , 2005)。
同时转为正常光照培养 。当愈伤组织长到约 5 mm 时, 把愈伤组织转移到培养基 4 (MS 大量元素和微量元素;
B5有机成分; 包含150 mg.L－1水解酪蛋白, 30 000 mg. . . L－1 蔗糖, 0. 2 mg L－1 萘乙酸, 2.0 mg L－1 6- 苄氨基嘌 呤, 1 000 mg.L－1琼脂, pH 5. 8－6. 0), 诱导不定芽形成。
黑腐病、黑胫病和根肿病抗性。受体花椰菜 (B. olerac ea var. botryt is , CC, 2n=18)编号 0307, 由 北京市农林科学院蔬菜研究中心提供, 经本中心生物技 术室筛选出的原生质体培养良好及植株再生能力强的材 料。受体材料种子常规消毒后, 在 MS 基本培养基上萌 发, 24°C 暗培养 6 天后, 取下胚轴用于原生质体制备。 供体材料的无菌苗在 MS 培养基中培养, 每次取 3－5 片 幼 叶 用 于 叶 肉 原 生 质 体 制 备。
当幼苗的真叶形成时, 转移到无激素的培养基中, 使再生 植株正常生长并生根。
1.4 杂种植株鉴定
1. 4.1 分子标记鉴定杂种植株 植物总 D N A 提取采用 C TA B 法。D N A 浓度采用 Techcomp UV -VIS8500 紫外分光光度计检测, 最后将
纯化后的 DNA 稀释至 50 ng.µL－1 备用。
1.2 原生质体的分离纯化及融合
原生质体的分离纯化按本实验室建立的芸薹属植物下胚 轴及叶肉原生质体的分离纯化方法进行( 姚星伟等, 2005)。叶肉原生质体调整密度至每毫升 2×106 个, 以 每皿 5 mL 铺于直径为 9 c m 的培养皿中, 用 UV 射线照 射后, 离心力为 111. 8 ×g, 离心 5 分钟。分别调整供、 受体原生质体浓度至每毫升 2×106 个, 按1: 1(v/v)的比例 混合。原生质体融合采用 P EG 融合法, 按照 Ryschka 等(1996)的方法进行, 略作修改。步骤如下: 在直径为 5 cm 的无菌塑料培养皿中滴入 7 滴混合原生质体溶液, 每滴 40 µL, 静置 10 分钟, 使原生质体沉积在培养皿底 部; 然后在每滴两侧加 60 µL 40% P EG 溶液, 5 分钟 后, 稍微倾斜培养皿, 去掉培养皿中的混合液; 随后加入 13% 的 PE G 溶液 2 mL, 5 分钟后去掉; 再加入 6. 7% 的 PE G 溶液 2 mL, 5 分钟后去掉。用培养基 1(B5 培
1. 4.1.2 SRAP 分析 采用一对在双亲中表现出扩增差异的引物进行再生植株
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杂种特性的 S RA P(s equence-related ampl ified poly morphism)分析 (Li et al., 2001)。上游引物(由北 京赛百盛基因技术公司合成) m e 7 序列为: 5 ' TGAGTCCA AACCGGTTG-3', 下游引物em5序列为: 5'GACTGCGTA CGA ATTA AC-3'。P CR 反应体系: 总反
黑芥(Brass ica nigra)是芸薹属 3 个基本种之一, 其 B 基因组携带黑腐病(blac k rot)、黑胫病(blac k leg)和 根肿病(c lubroot )的抗性基因(S ac rist an et al. , 1989; Sjödin and Glimelius ,1989)。利用含 B B 基因组的芸
呤, pH 5. 8－ 6. 0)洗涤培养皿 2 次后, ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ进入原生质 体培养。
1.3 原生质体培养及植株再生
完成融合处理后, 在直径 5 c m 的培养皿中加入 2 mL 培 养基 1, 于 24 °C 暗培养。3－ 7 天后, 当观察到较多的 细胞进入一次分裂时, 向每培养皿中加入400 µL培养基 2(B 5 培养基大量元素、微量元素和有机成分; 包含 150
mg.L－1水解酪蛋白, 2 500 m .g L－1葡萄糖, 125 m .g L－1 2- 脱氧核糖, 20 000 m .g L－1蔗糖, 0.5 m .g L－1 2,4-二氯 苯氧乙酸, 0.2 m .g L－1 萘乙酸, 0.2 m .g L－1 6- 苄氨基嘌