质谱数据定量方法解析共39页
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质谱分析法--定性与定量_图文
GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测 “如果检测结果用回收率进行校准，应在原始记录的结 果中明确说明并描述校准公式”
三、定量方法
2. 内标法
Ø 单点校正法 Ø 内标标准曲线法
三、定量方法
2. 内标法
内标物要满足以下要求： （a）试样中不含有该物质； （b）与被测组分性质比较接近； （c）不与试样发生化学反应； （d）出峰位置应位于被测组分附近。
ESIESI+
m/z- 179→79.9 m/z + 202→122
甜蜜素
SN/T 1948-2007 进出口食品中环己基氨
基磺酸钠的检测方法
应研究样品基质和检测器 性能引起的图谱改变
化合物 麻黄碱 伪麻黄碱
保留时间 （min）
6.9
8.0
定性离子对
166/148 166/133 166/148 166/133
•C7H6N2O2 8.50 0.72 0.45
化合物 C7H11N4
M+1 9.25
C8H6 O3 8.36
C8H8NO2 9.23
C8H11N2O 9.61
C8H12N3 9.98
二、定性（确证）方法
1. 基本原则
Ø质谱法只有在与色谱分离在线或脱机联用时才能作 为确证方法 Ø在分析仪器上的进样顺序是：空白溶剂、阴性控制 样品、要确证的样品、阳性控制样品再进样，最后是 阴性控制样品
Ø 扫描速度
ü色谱峰的数据点数目和峰宽、扫描时间有关
Ø 分辨率
质谱仪主要性能指标
质谱仪主要性能指标
分辨率
磁质谱的分辨率定义最为严格：对两个相等 强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时 ，则认为两峰已经分开，其分辨率：
三、定量方法
2. 内标法
Ø 单点校正法 Ø 内标标准曲线法
三、定量方法
2. 内标法
内标物要满足以下要求： （a）试样中不含有该物质； （b）与被测组分性质比较接近； （c）不与试样发生化学反应； （d）出峰位置应位于被测组分附近。
ESIESI+
m/z- 179→79.9 m/z + 202→122
甜蜜素
SN/T 1948-2007 进出口食品中环己基氨
基磺酸钠的检测方法
应研究样品基质和检测器 性能引起的图谱改变
化合物 麻黄碱 伪麻黄碱
保留时间 （min）
6.9
8.0
定性离子对
166/148 166/133 166/148 166/133
•C7H6N2O2 8.50 0.72 0.45
化合物 C7H11N4
M+1 9.25
C8H6 O3 8.36
C8H8NO2 9.23
C8H11N2O 9.61
C8H12N3 9.98
二、定性（确证）方法
1. 基本原则
Ø质谱法只有在与色谱分离在线或脱机联用时才能作 为确证方法 Ø在分析仪器上的进样顺序是：空白溶剂、阴性控制 样品、要确证的样品、阳性控制样品再进样，最后是 阴性控制样品
Ø 扫描速度
ü色谱峰的数据点数目和峰宽、扫描时间有关
Ø 分辨率
质谱仪主要性能指标
质谱仪主要性能指标
分辨率
磁质谱的分辨率定义最为严格：对两个相等 强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时 ，则认为两峰已经分开，其分辨率：
质谱法简介—质谱法基本原理(分析化学课件)
m/z 123 －CH3
－CO 108
80
m/z 80 离子是由分子离子经过两步裂解产生的，而不是一步形成的
质谱法基本原理
4.同位素离子
大多数元素都是由具有一定自然丰度的同位素组成。化合物 的质谱中就会有不同同位素形成的离子峰，由于同位素的存在， 可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰M+1；有时还可以 观察到M+2，M+3。通常把由同位素形成的离子峰叫同位素峰。
离子子还可能进一步裂解成更小的碎片离子，在裂解的同时也可能
发生重排。
质谱法基本原理
3.亚 稳 离 子（m*）
在离子源中形成的碎片离子没有进一步裂解，而是在 飞行进入检测器的过程中发生自行的裂解，这样所形成的低 质量的离子叫亚稳离子。 形成过程 m1 (母离子) m2 (子离子) 中性碎片
表观质量 m m22
37
(a+b)n=(3+1)2=9+6+1
即三种同位素离子强度之比为9:6:1。 这样，如果知道了同位素的元素个数，可以推测各同
位素离子峰强度之比。 同样，如果知道了各同位素离子强度之比，可以估计
出分子中是否含有S、Cl、Br原子以及含有的个数。
质谱法基本原理 四、质谱法的特点与主要用途
❖ 特点： ❖ 1．样品用量少。灵敏度高，精密度好。 ❖ 2．分析速度快。 ❖ 3．分析范围广，适合联机。 ❖ 4．能够同时给出样品的精确分子质量和结构信息
色谱-质谱联用分析法 气质联用（GC-MS）的应用领域：
气质联用已经成为有机化合物常规检测中的
必备工具。环保领域的有机污染物检测，特别是
低浓度的有机污染物；药物研究生产质控的进出
口环节；法庭科学中对燃烧爆炸现场调查，残留
质谱分析学习.pptx
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（3）麦氏重排
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四、醇
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第46页/共95页
第47页/共95页
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五、酚
第49页/共95页
六、醛酮
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第51页/5页
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八、胺
1、分子离子峰 脂肪族胺的分子离子峰很弱， 环胺、芳胺的分子离子峰很强。
2、断裂方式
第54页/共95页
第55页/共95页
九、酰胺
1、分子离子峰 酰胺类分子离子峰通常可测到。
2、断裂方式（具有羰基裂解的特点）
第56页/共95页
十、硝基化合物
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第58页/共95页
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第72页/共95页
这规则用于其他碎片离子时，则是含偶数个氮原子的奇电子 离子其质量是偶数；而含偶数个氮原子的偶电子离子其质量 将是奇数。而分子离子均是奇电子离子。应含偶数个（不含 氮）氮原子。 （4）必须有合理的质量碎片的丢失。分子离子峰的裂解过程 中常常会失去小质量的中性碎 片和自由基。因此裂解过程中 分子离子（母离子）与子离子之间的质量差一定要合理，例 如出现质量差15或18，就丢失-CH3或一个分子水是合理的。 而丢失4~13原子质量单位是不合理的。因为分子离子
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醇类容易失水，出现(M-18) +峰。有些硝基化合物、易于分 解的有机化合物及支链烷烃，在电子轰击条件下得不到分子 离子峰，只有碎片峰。
（3）分子离子应符合氮规则。有机化合物主要由C、H、O、 N、S、CI、Br、1、F、P等元素组成。在质谱中有机化合 物分子中含有偶数个（包括零）氮原子的分子离子，质量一 定是偶数；而含有奇数个氮原子的分子离子，质量数一定是 奇数，这个规则称为“氮规则”。因为某些元素的最大丰度 的同位素（轻同位素）的原子的质量数为偶数，其化合价亦
（3）麦氏重排
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四、醇
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五、酚
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六、醛酮
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八、胺
1、分子离子峰 脂肪族胺的分子离子峰很弱， 环胺、芳胺的分子离子峰很强。
2、断裂方式
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九、酰胺
1、分子离子峰 酰胺类分子离子峰通常可测到。
2、断裂方式（具有羰基裂解的特点）
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十、硝基化合物
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这规则用于其他碎片离子时，则是含偶数个氮原子的奇电子 离子其质量是偶数；而含偶数个氮原子的偶电子离子其质量 将是奇数。而分子离子均是奇电子离子。应含偶数个（不含 氮）氮原子。 （4）必须有合理的质量碎片的丢失。分子离子峰的裂解过程 中常常会失去小质量的中性碎 片和自由基。因此裂解过程中 分子离子（母离子）与子离子之间的质量差一定要合理，例 如出现质量差15或18，就丢失-CH3或一个分子水是合理的。 而丢失4~13原子质量单位是不合理的。因为分子离子
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醇类容易失水，出现(M-18) +峰。有些硝基化合物、易于分 解的有机化合物及支链烷烃，在电子轰击条件下得不到分子 离子峰，只有碎片峰。
（3）分子离子应符合氮规则。有机化合物主要由C、H、O、 N、S、CI、Br、1、F、P等元素组成。在质谱中有机化合 物分子中含有偶数个（包括零）氮原子的分子离子，质量一 定是偶数；而含有奇数个氮原子的分子离子，质量数一定是 奇数，这个规则称为“氮规则”。因为某些元素的最大丰度 的同位素（轻同位素）的原子的质量数为偶数，其化合价亦
质谱分析法
1 mυ2 = zU 2
m:离子质量 υ :离子的速度 z:离子所带的电荷数 U:加速电压
加速后的离子进入磁场，在磁场的作用下，带电离子按曲 线轨迹飞行； mυ2 离心力 =向心力； = Bzυ 曲率半径： 质谱方程式：
R 2Um 1 R = ( 2 )2 Bz 2 2 m BR = z 2U
离子在磁场中的轨道半径R取决于: m/z ; B; U (1)若加速电压U和磁场强度B都一定时，不同m/z 的离 子，由于运动的曲率半径不同，在质量分析器重彼此 被分开，并记录各m/z离子的相对强度。 (2)固定R，B，连续改变加速电压U，电场扫描法。 固定R，U，连续改变磁场强度B，磁场扫描法。
质谱图解析 （C6H12O结构未知，酮） 结构未知，
解析： 1． 100，分子离子峰 2．85，失去CH3（15）的产物 3．57, 丰度最大, 稳定结构 失去CO(28)后的产物
O CH3 ‖∣ CH3-C-C-CH3 ∣ CH3
第七章 质谱分析法
1、什么是质谱？ 2、质谱仪主要是由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、 数据记录系统组成的。 3、离子源和质量分析器都需要在高真空下工作。 4、质谱方程式；
1.质谱法是唯一可以确定物质分子质量的方法，且可 以确定化合物的化学式和进行结构分析。 2.灵敏度极高，鉴定最小量达10-10g，检出限可达10-14g。
质谱分析法基本原理
质谱法是采用高速电子来撞击气态分子或原子， 质谱法是采用高速电子来撞击气态分子或原子，将 电离后的正离子加速导入质量分析器中， 电离后的正离子加速导入质量分析器中，然后按质荷比 （m/z）的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。 ）的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。 质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。 质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。
m:离子质量 υ :离子的速度 z:离子所带的电荷数 U:加速电压
加速后的离子进入磁场，在磁场的作用下，带电离子按曲 线轨迹飞行； mυ2 离心力 =向心力； = Bzυ 曲率半径： 质谱方程式：
R 2Um 1 R = ( 2 )2 Bz 2 2 m BR = z 2U
离子在磁场中的轨道半径R取决于: m/z ; B; U (1)若加速电压U和磁场强度B都一定时，不同m/z 的离 子，由于运动的曲率半径不同，在质量分析器重彼此 被分开，并记录各m/z离子的相对强度。 (2)固定R，B，连续改变加速电压U，电场扫描法。 固定R，U，连续改变磁场强度B，磁场扫描法。
质谱图解析 （C6H12O结构未知，酮） 结构未知，
解析： 1． 100，分子离子峰 2．85，失去CH3（15）的产物 3．57, 丰度最大, 稳定结构 失去CO(28)后的产物
O CH3 ‖∣ CH3-C-C-CH3 ∣ CH3
第七章 质谱分析法
1、什么是质谱？ 2、质谱仪主要是由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、 数据记录系统组成的。 3、离子源和质量分析器都需要在高真空下工作。 4、质谱方程式；
1.质谱法是唯一可以确定物质分子质量的方法，且可 以确定化合物的化学式和进行结构分析。 2.灵敏度极高，鉴定最小量达10-10g，检出限可达10-14g。
质谱分析法基本原理
质谱法是采用高速电子来撞击气态分子或原子， 质谱法是采用高速电子来撞击气态分子或原子，将 电离后的正离子加速导入质量分析器中， 电离后的正离子加速导入质量分析器中，然后按质荷比 （m/z）的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。 ）的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。 质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。 质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。
质谱数据定量分析方法
3,4 5,6
K1Ti2 K2Ti4 i
, i 7,8
K T2 i4 i
,i 9,10
10
2
f i
f K1
10
2 i
i 1
i K1
0
f
特点 K2
i 110
2 i
i 1
i K 2
0
f C
10
王腾蛟 硕士生---马海滨
谢谢大家！
RT对齐
LC-MS策略：寻找共同的肽段信号，建立非线性 模型
LC-MS/MS策略：利用共同鉴定肽段的RT建立对 齐模型
对齐模型：3次样条，局部回归，小波，分段线 性，偏移向量等
作用：对LC-MS/MS策略，可以弥补鉴定信息的 不足，提高MS图谱信号利用率
信号归一化和差异显著性检验
图 谱 水 平
去噪方法 谱峰定量信息
同位素峰
X 不去噪
Xcalibur默认 小波去噪
最大值 平滑积分 函数拟合 信号加和
X
单一 最高
全部
X
肽 段 水 平
X XIC处理 小波去噪 平滑去噪 连续性截断
XIC定量
平滑积分 函数拟合
误差分析
信号加和
共3*4*3*4*3=432种计算流程
比较原则：重复实验的CV值最小
定量精度和参数优化
到定量完成的全流程 自动化，有GUI界面
速度：1 s可以定量1000
个肽段
支持pepXML，protXML， mzXML，mzData， mzML
蛋白质组装和未鉴定肽 段搜索
RT对齐、信号归一化
LC-MS策略支持软件XICFinder
质谱分析的原理与方法
灵敏度高：微克级样品
有机质谱仪绝对灵敏度为50pg（pg为1012g）
无机质谱仪绝对灵敏度为10-14g
分析速度快,可多组分同时检测 仪器结构复杂，价格昂贵
质谱仪
质谱仪的结构
进样系统 离子源 质量分析器 检测器和记录器
GC—MS（气相色谱—质谱联用仪）
Gas Chromatograph—Mass Spectrometer
分子离子峰必要的、但非充分的条件： 1、它必须是图谱中最高质量端的离子（分子
离子峰的同位素峰及其络合离子除外）；
2、它必须是奇电子离子；
3、它必须能够通过丢失合理的中性碎片，产
生图谱中高质量区的重要离子。
分子离子峰与碎片峰的区分： 1、注意质量是否符合氮元素规则； 2、注意该峰与邻近峰之间的质量差是否合理 （一般认为质量差为4-14，21-25，37，38， 50-53，65，66等是不合理的丢失）； 3、注意M+1峰（醚、酯、胺、酰胺、氨基酸 酯和胺醇等）； 4、注意M-1峰（醛、醇或含氮化合物）。
LC—MS（液相色谱—质谱联用仪） Liquid Chromatograph—Mass Spectrometer
质谱表示方法
Abscissa: m/e (mass charge ratio) 横坐标：质荷比 Y—coordinate: ion—current intensity 纵坐标：离子流强度
根据“氮规则”、M=181，化合物分子式为e 71
+
CH3 CH2CH3
CH3CH2CH2CH2CH2CH3
CH3CH2CH2CH2+ + m/e 57 CH3CH2CH2+ + m/e 43 CH3CH2+ + m/e 29
质谱数据定量分析方法
不需要鉴定信息，直接从MS图谱中解析同位素 峰簇
考虑了XIC截断，同位素峰叠加，母离子误差校 正等问题
提供了信噪比、同位素分布拟合优度等过滤 测试：发现采用严格过滤规则，则鉴定肽段也
可能不能定量，说明和LC-MS/MS策略可以相互 补充
第三部分：进一步的思考
预分离和信号归一化
SDS分离 蛋白质多条带分布 条带切割的不均匀性 不同实验之间信号不可比
标记定量：比值，定量指标 无标定量：定量指标
肽段定量指标计算
可选步骤
去噪处理：小波，平 滑滤波
XIC峰形拟合：复杂的 类高斯函数
XIC边界确定：信噪比， 连续性，局部最小 值
母离子匹配误差分布： 提高精度？
标记定量：比值计算，MaxQuant采用了最小二乘拟合法 问题：不同试剂标记的肽段XIC平移，差异越大，表现越明显 无标记定量：定量指标计算
定量软件-Mascot
支持的定量类型
多种标记定量， MS/MS图谱 定量， emPAI， 重复实验 Label free， 选择信号最强的3 个肽段
数据处理算法特色
基于m/z和RT的对齐，多种XIC积分方法，多参数鉴定结果过滤，outliers排 除，归一化处理（利用均值）
使用方法
在搜库前定义修饰和定量的参数（通过修改XML文件实现），搜库，然后 使用Distiller定量
差异显著性检验 从肽段到蛋白质的信息综合：平均？筛选？ 异方差问题：信号越弱，误差分布越宽
一个例子
XIC
定量信息:TGVIVGEDVHNLFTYAK
图谱计数SC 126 70 3 4
XIC面积SA(对数) 8.54 7.56 5.15 5.89
保留时间RT 53.661617 58.135022 59.199630 57.643797
考虑了XIC截断，同位素峰叠加，母离子误差校 正等问题
提供了信噪比、同位素分布拟合优度等过滤 测试：发现采用严格过滤规则，则鉴定肽段也
可能不能定量，说明和LC-MS/MS策略可以相互 补充
第三部分：进一步的思考
预分离和信号归一化
SDS分离 蛋白质多条带分布 条带切割的不均匀性 不同实验之间信号不可比
标记定量：比值，定量指标 无标定量：定量指标
肽段定量指标计算
可选步骤
去噪处理：小波，平 滑滤波
XIC峰形拟合：复杂的 类高斯函数
XIC边界确定：信噪比， 连续性，局部最小 值
母离子匹配误差分布： 提高精度？
标记定量：比值计算，MaxQuant采用了最小二乘拟合法 问题：不同试剂标记的肽段XIC平移，差异越大，表现越明显 无标记定量：定量指标计算
定量软件-Mascot
支持的定量类型
多种标记定量， MS/MS图谱 定量， emPAI， 重复实验 Label free， 选择信号最强的3 个肽段
数据处理算法特色
基于m/z和RT的对齐，多种XIC积分方法，多参数鉴定结果过滤，outliers排 除，归一化处理（利用均值）
使用方法
在搜库前定义修饰和定量的参数（通过修改XML文件实现），搜库，然后 使用Distiller定量
差异显著性检验 从肽段到蛋白质的信息综合：平均？筛选？ 异方差问题：信号越弱，误差分布越宽
一个例子
XIC
定量信息:TGVIVGEDVHNLFTYAK
图谱计数SC 126 70 3 4
XIC面积SA(对数) 8.54 7.56 5.15 5.89
保留时间RT 53.661617 58.135022 59.199630 57.643797
质谱数据定量分析方法详解演示文稿
异方差问题：信号越弱，误差分布越宽
第十一页，共三十四页。
一个例子
XIC
定量信息:TGVIVGEDVHNLFTYAK
图谱计数SC 126 70 3 4
XIC面积SA(对数) 8.54 7.56 5.15 5.89
保留时间RT 53.661617 58.135022 59.199630 57.643797
4.3
0.72 0.003
2.2
0.34 0.003
数据产生 LTQ/FT分析Yeast样品，SEQUEST搜库， Target-decoy过滤（FDR=0.01），取Scan
number最小的记录
第十二页，共三十四页。
定量软件
Cencus、 CRAWDAD、
MaxQuant
软件在可视化、 速度、数据文 件格式支持、 算法精度和实 验策略支持等 方面有很大发 展空间
XIC峰形拟合：复杂的类高 斯函数
XIC边界确定：信噪比， 连续性，局部最小值
母离子匹配误差分布： 提高精度？
标记定量：比值计算，MaxQuant采用了最小二乘拟合法 问题：不同试剂标记的肽段XIC平移，差异越大，表现越明显 无标记定量：定量指标计算
第九页，共三十四页。
RT对齐
LC-MS策略：寻找共同的肽段信号，建立非线性模型 LC-MS/MS策略：利用共同鉴定肽段的RT建立对齐模
型 对齐模型：3次样条，局部回归，小波，分段线性，偏
移向量等
作用：对LC-MS/MS策略，可以弥补鉴定信息的不足，
提高MS图谱信号利用率
第十页，共三十四页。
信号归一化和差异显著性检验
信号归一化 目的：针对无标记定量，消除不同实验间的系 统误差
基本方法：寻找不变量
第十一页，共三十四页。
一个例子
XIC
定量信息:TGVIVGEDVHNLFTYAK
图谱计数SC 126 70 3 4
XIC面积SA(对数) 8.54 7.56 5.15 5.89
保留时间RT 53.661617 58.135022 59.199630 57.643797
4.3
0.72 0.003
2.2
0.34 0.003
数据产生 LTQ/FT分析Yeast样品，SEQUEST搜库， Target-decoy过滤（FDR=0.01），取Scan
number最小的记录
第十二页，共三十四页。
定量软件
Cencus、 CRAWDAD、
MaxQuant
软件在可视化、 速度、数据文 件格式支持、 算法精度和实 验策略支持等 方面有很大发 展空间
XIC峰形拟合：复杂的类高 斯函数
XIC边界确定：信噪比， 连续性，局部最小值
母离子匹配误差分布： 提高精度？
标记定量：比值计算，MaxQuant采用了最小二乘拟合法 问题：不同试剂标记的肽段XIC平移，差异越大，表现越明显 无标记定量：定量指标计算
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RT对齐
LC-MS策略：寻找共同的肽段信号，建立非线性模型 LC-MS/MS策略：利用共同鉴定肽段的RT建立对齐模
型 对齐模型：3次样条，局部回归，小波，分段线性，偏
移向量等
作用：对LC-MS/MS策略，可以弥补鉴定信息的不足，
提高MS图谱信号利用率
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信号归一化和差异显著性检验
信号归一化 目的：针对无标记定量，消除不同实验间的系 统误差
基本方法：寻找不变量