病毒的分离培养标准操作规程
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。
1.病毒的分离1.1标本的处理1.1.1标本的收集a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。
b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。
c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。
1.1.2 除菌处理a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4小时。
c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。
1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。
根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
1.2.1 鸡胚接种a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致。
b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。
①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。
②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
病毒分离技术操作规范
病毒分离技术操作规范==========================1. 目的--------本操作规范的目的是确保病毒分离技术能够安全有效地进行，以获取纯净的病毒样品，用于后续的研究和分析。
2. 背景--------病毒分离技术是一项重要的实验技术，用于从感染源中分离出特定的病毒。
正确操作病毒分离技术可以减少污染风险，最大程度地保留病毒的活性和纯度。
3. 设备和试剂--------3.1 设备- 生物安全柜（BSC）- 做实验的实验室- 高速离心机- 恒温培养箱- 无菌工作台3.2 试剂- 细胞培养基- 抗生素- 洗涤缓冲液- 离心管- 密封的4. 操作步骤--------4.1 准备工作1. 在正压下进入生物安全柜，穿戴个人防护装备。
2. 清洗和消毒所有需使用的设备和试剂。
3. 在生物安全柜内准备全部实验所需的试剂和设备。
4.2 细胞培养1. 从培养基中使用无菌技术获取所需的细胞。
2. 将细胞转移到含有适当培养条件的培养基中。
3. 在恒温培养箱中培养细胞至达到需求的数目。
4.3 感染细胞1. 使用合适的病毒样品对培养中的细胞进行感染。
2. 根据研究需求，控制感染的时间和病毒浓度。
4.4 收集病毒1. 在感染后的适当时间点，收集感染细胞培养基。
2. 使用离心机离心培养基，将其中的细胞沉淀和病毒浮游物分离开。
4.5 存储病毒1. 将病毒浮游物分离到密封的中。
2. 储存时保持冷藏，避免病毒样品的受损。
5. 注意事项--------- 操作过程中严格遵守生物安全操作规范，确保自身和他人的安全。
- 避免交叉感染，确保实验设备和使用的试剂都是无菌的。
- 尽可能减少研究材料的暴露时间，在合适的条件下进行操作，以保持病毒样品的纯度和活性。
参考文献--------Publication Manual of the American Psychological Association(6th Ed.). (2010). Washington, DC: American Psychological Association.。
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
鸡胚法病毒分离培养作业指导书
1.目的规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。
2.依据标准《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A<仅限A1，A2.1>,附录G《全国流感监测技术指南》附件1<一、四、五>3.适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定4.实验室生物安全级别及个人防护对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。
在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。
5.标本的采集、处理和储存5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃冰箱，并马上送至实验室。
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。
5.2标本处理实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。
标本在实验室内/间转运时需有双层防护包装。
标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。
收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。
按标本类型不同分别处理：鼻、咽拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。
咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。
处理前将合适尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全柜内操作区。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养方法病毒的分离培养是研究病毒性疾病、病毒结构和功能、病毒生物学特性的重要手段。
病毒是一种非细胞微生物，无法在无细胞环境中生长和繁殖，必须依赖于寄主细胞来完成其生命周期。
因此，病毒的分离培养方法主要是利用其对特定细胞的感染能力，通过培养和增殖来获取纯净的病毒制备。
首先，病毒的分离培养需要获得感染病毒的组织或细胞，这些组织或细胞通常是患者的血液、组织样本或培养细胞。
在获得样本后，需要进行样本的处理和制备。
通常的处理方法包括离心、滤过、稀释等步骤，以去除细胞碎片、细菌等杂质，获得纯净的病毒颗粒。
其次，病毒的分离培养需要选择合适的寄主细胞进行培养。
不同的病毒对细胞有不同的选择性，因此需要根据病毒的特性选择合适的细胞系。
常用的细胞系包括Vero细胞、MDCK细胞、A549细胞等。
将处理后的样本接种到寄主细胞上，让病毒感染细胞并进行增殖。
接着，病毒的分离培养需要进行病毒的纯化和扩增。
通过离心、超速离心、密度梯度离心等方法，可以将病毒颗粒从细胞碎片、蛋白质等杂质中分离出来，获得纯净的病毒制备。
然后，将纯净的病毒制备接种到新的寄主细胞中，进行扩增和增殖。
最后，病毒的分离培养需要对病毒进行鉴定和检测。
通过电镜观察病毒的形态特征，利用免疫学方法检测病毒的抗原，进行核酸检测等手段，可以对病毒进行鉴定和检测，确定其种属和特性。
总之，病毒的分离培养是一项复杂而重要的实验技术，对于病毒学研究和病毒性疾病的防控具有重要意义。
掌握病毒的分离培养方法，可以为病毒学研究提供纯净的病毒制备，为病毒性疾病的诊断和防控提供重要的实验支持。
希望本文介绍的病毒的分离培养方法对您有所帮助。
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病毒的分离培养标准操作规程
1．目的：规范病毒分离及鉴定培养操作流程，保证试验结果的重复性和稳定性。
2．术语：EID50/0.1ml，ELD50/0.1ml，TCID50/0.1ml，CPE
3．操作程序与方法：
3.1 采样：对于病死或剖杀动物，采集病毒主要聚集组织部位，一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等；对于活体动物，可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位（口腔、鼻腔、生殖道、肛门等）的分泌液。
采集样品如不能立即处理，应冻存与-20℃备用。
长
途运输应用冰盒或4℃低温保存。
3.2 样品处理：组织块可用剪刀剪碎并研磨，加入10倍体积含300-500UI/ml青、
链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500UI/ml 青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
8000rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，透过液即为病毒原液，收集保存，短期保存4℃，长期保存用液氮。
3.3接种培养：将病毒原液接种与特定细胞单层中，连续盲传4-6代，观察细胞是
否产生特异性CPE，并计算及TCID50/0.1ml。
禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定，并计算及EID50/0.1ml和ELD50/0.1ml。
3.4 病毒纯化：采用“有限梯度稀释法”结合“噬斑纯化法”对病毒进行纯化；
3.5 动物回归实验：分离培养并纯化好的病毒回归接种动物，观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。
3.6分子生物学鉴定：基因组提取并设计特异性引物，对分离病毒保守区基因片段
进行特异性扩增，并测序，从分子水平对其进行鉴定。
3.7血清学鉴定：用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞
或鸡胚验证病毒特异性。
或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性。
4.注意事项
4.1采样过程应做好自身防护，烈性病不得随意分离。
4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理，避免病毒扩散到环境中。
4.3 纯化好毒种应及时做好扩毒并建立毒种库。
1。