构建点突变质粒步骤
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【摘要】目的：构建Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240（T240）和Threonine429（T429）的点突变质粒，并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。
方法：利用定点突变技术，对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变，通过双酶切的方法获得Tudor-SN.Mutants片段，最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。
在HeLa细胞中转染该质粒，利用Western blot技术检测质粒表达效率。
结果：（1）重组质粒经双酶切鉴定，可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。
（2）转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。
结论：质粒构建成功，可以用于下一步科学研究使用。
%Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag. Methods:The Serine426 (S426), Serine781(S781), Threonine240(T240)andThreonine429(T429)of Tudor-SN were transformed into Alanine by site-directed mutagenesis technique. Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion, and then inserted into pCMV-N-Flag vector. The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot. Results:(1)The vector and Tudor-SN. Mutants could be observed by restricting double enzyme digestion.(2)Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid. Conclusion:The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully, and may be useful for further study.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P5-8)【关键词】人类Tudor-SN蛋白;pCMV-N-Flag;重组质粒;融合蛋白【作者】杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【作者单位】天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070; ]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070【正文语种】中文【中图分类】Q7Abstract Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag.Methods：The Serine426（S426）,Serine781（S781）,Threonine240（T240）and Threonine429（T429）of Tudor-SN were transformed into Alanine by site- directed mutagenesis technique.Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion,and then inserted into pCMVN-Flag vector.The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot.Results：（1）The vectorand Tudor-SN.Mutants could beobserved by restricting double enzyme digestion.（2）Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid.Conclusion：The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully,and may be useful for furtherstudy.Key words human Tudor-SN；pCMV-N-Flag；recombinant plasmid；fusion protein人类Tudor-SN蛋白，又称SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）或p100，该蛋白首次以EB病毒细胞核抗原2（epstein-barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的转录共激活因子被发现[1]。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR )等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化), 包括碱基的添加、删除、点突变等。
一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点,弓I物一般长25~45 bp ,设计的突变位点需位于引物中部。
二、反应1.使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。
2.反应体系：(1) 10x pyrobest Buffer: 5 ul(2 ) dNTP Mixture(10 mM) : 1 ul(3 )模板DNA(5~50 ng) : lul(4) primer 1 (125 ng) : 1 ul(5 ) primer 2 (125 ng) : 1 ul(6 ) pyrobest DNA polymerase ( TaKaRa ) (5 U/ul) : 0.25 ul(7 )加无菌蒸憎水至50ul.三.产物沉淀纯化1.加1/10体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上(或-20°C冰箱)5min ,离心弃上清。
2.70-75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中(此步可省略，直接用Dpnl 酶切)。
四、Dpnl酶切1.酶切体系(1) Buffer : 2 ul(2 ) BSA (100x ) : 0.2 ul(3 ) DNA : xul(4) Dpnl: 0.5 ul(5 )加无菌去离子水至20 ul。
2.3(TC酶切1~4 h。
3.65°C水浴15min终止反应。
五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株,利用抗生素筛选突变子。
六、测序验证注意事项1.引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
环状质粒 pcr 构建定点突变序列
环状质粒 pcr 构建定点突变序列
定点突变是一种将特定位点上的碱基改变为另一种碱基的技术，在分子生物学研究中有广泛应用。
通过 PCR 构建定点突变序列可以方便快速地获得预期的突变序列。
以下是环状质粒 PCR 构建定点突变序列的步骤：
1. 设计引物：设计两对引物，其中一对含有突变序列，另一对不含突变序列，使其在 PCR 反应中扩增出突变序列的目的片段。
2. 生成模板 DNA：从目标环状质粒中提取 DNA，并按照 PCR 反应条件进行适当稀释和纯化，以获得合适的模板DNA。
3. PCR 扩增：使用上述引物对模板 DNA 进行 PCR 扩增，生成包含突变序列的 PCR 产物。
4. 酶处理：将 PCR 产物用限制酶进行酶切，以将突变序列与目标环状质粒分开。
5. 连接重新组装：使用 T4 连接酶将酶切产物重新连接为完整的环状质粒，并进行适当纯化和检测。
通过上述步骤，可以方便快速地获得定点突变的环状质粒序列，为分子生物学研究提供了有力的工具。
质粒定点突变操作步骤
质粒定点突变
1.简介
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
本实验主要原理是设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶循环延伸后用Dpnl 酶切延伸产物。
由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切碎（Dpnl 识别序列为甲基化的GATC，GA TC在几乎各种质粒中不止一次出现），而体外合成的突变质粒没有甲基化不被消化因此得以在成功转化，随后得到突变的质粒克隆。
2.材料
2.1试剂
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（诺唯赞Vazyme Biotech，#P505-d1-AA）
2 × Phanta Max Buffer（诺唯赞Vazyme Biotech，#PB505）
dNTP Mix (10 mM each)（诺唯赞Vazyme Biotech，# P031-01/02）
DMSO
3.步骤
1、设计一对包含突变位点的互补引物。
2、反应体系
反应程序
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分混匀，用完之后请及时放回-20℃保存。
3、反应产物加入0.5 μl Dpnl酶，37 ℃静置>2 hs。
4、静置后取2 μl加入100 μl Turbo进行转化，后面步骤同分子克隆。
质粒的构建
质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子，通常大小在1-200 kb之间，其中包含了一个或多个基因编码序列，以及与复制、表达等相关的功能序列。
质粒通常由多个功能区域组成，包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。
1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤：基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选，这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。
1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。
通过构建特定功能的质粒，可以实现对基因的操控和调控，对生物学功能进行研究。
二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因，得到目的基因片段。
基因片段的选择根据实验需要，可以是全长基因、部分序列、突变体等。
2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。
通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。
常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。
2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应，通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。
连接反应后，通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。
2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程，通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。
2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目的质粒的阳性克隆。
通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。
三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中，实现基因的操控和表达。
通过构建携带感兴趣基因的质粒，可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。
3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列，在宿主细胞中进行蛋白质表达。
通过构建携带目的基因的质粒，可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。
定点突变过表达质粒
定点突变过表达质粒
定点突变过表达质粒指的是在基因序列中通过特定的突变点，引入一种转录或翻译水平上过度表达的质粒或载体。
这种质粒常用于研究特定蛋白质功能、鉴定关键结构域以及评估在不同病理条件下的功能改变等。
要构建定点突变过表达质粒，首先需要确定目标基因的突变位点，这可以通过文献研究、结构生物学信息分析等方法来确定。
随后，可以采取多种方法来实现定点突变，如PCR扩增、聚合酶链反应、酶切和连接等。
具体操作步骤如下：
1. 设计合适的引物：根据目标基因的序列，设计与突变位点相匹配的特异性引物。
引物的设计要遵循引物设计原则，确保产生所需的突变。
2. 进行PCR扩增：使用设计的引物进行PCR扩增，从模板DNA中扩增出包含突变位点的目标基因片段。
3. 纯化产物：将PCR产物进行酶切或其他纯化方法，以获得纯净的片段。
4. 进行定点突变：使用突变引物和PCR产物作为模板，采用引物延伸方法，将突变引物与目标基因片段连接起来，形成含有突变的目标基因片段。
5. 构建表达载体：使用适当的酶切和连接技术，将突变的目标基因片段连接到表达载体中，如质粒或病毒载体，以构建定点突变过表达质粒。
6. 进行转染和表达：将构建好的质粒导入宿主细胞，并进行适当的培养和条件优化，以实现目标蛋白质的过表达。
最后，通过适当的测量和分析方法，如Western blot、荧光显微镜等，对目标蛋白质的定点突变过表达进行验证和表征。
总结而言，定点突变过表达质粒的构建需要确定突变位点、设计引物、进行PCR扩增和突变、连接到表达载体中等多个步骤。
这种质粒广泛应用于蛋白质功能研究和疾病机制的探索，为相关领域的研究提供了重要的工具和平台。
巨噬细胞点突变构建
巨噬细胞点突变构建
巨噬细胞点突变构建是一种生物学技术，用于研究巨噬细胞的基因功能和疾病机制。
下面是一个简单的构建流程：
1. 定点切割DNA：使用CRISPR-Cas9技术，通过人为设计的sgRNA引导Cas9蛋白对靶位点处的DNA进行切割，产生DNA双链断裂。
2. 同源重组修复DNA：将人为合成的含有突变位点的DNA序列作为同源修复模板，与sgRNA和Cas9蛋白一起转染进细胞。
3. 阳性细胞筛选：使用稀释法将细胞池细胞稀释转移到96孔板中，形成单克隆细胞。
然后收集单克隆细胞进行大量测序，以得到预期的纯合子细胞。
巨噬细胞点突变构建是一个复杂的过程，需要对基因组编辑、细胞培养和分子生物学等方面有深入的了解和丰富的经验。
如果你需要构建巨噬细胞点突变模型，建议咨询专业的生物技术公司或实验室。
构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
一、引言
本文旨在介绍构建点突变质粒的具体步骤。
点突变是指在DNA的序列中改变单个碱基，通常用于研究蛋白质结构和功能。
点突变可以通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术实现。
二、材料和方法
2.1 PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）是指在高温下使DNA变性，然后利用Taq聚合酶进行DNA扩增。
PCR扩增需要设计两个引物，引物的长度一般为20-30bp，引物的浓度一般为0.1uM。
PCR扩增的反应条件如下：94℃变性2min→94℃ 30s→58-65℃ 30s→72℃ 1min/kb（循环30-35次）→72℃5min停止反应。
PCR扩增的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。
2.2 DNA纯化
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
将样品加入吸附柱，再加入洗涤缓冲液将杂质洗掉，最后加入洗脱缓冲液使DNA从柱子中洗脱出来。
2.3 定向克隆
定向克隆是指利用限制性内切酶切割DNA，然后进行质粒载体的克隆。
先将PCR产物与质粒载体酶切后连接，然后转化到大肠杆菌中，通过筛选获得阳性克隆子。
在定向克隆的过程中需要注意引物的合成和酶切位点的选择，以保证克隆效率和准确性。
2.4 测序
测序是指对克隆子的DNA序列进行测定和分析。
将克隆子的DNA片段进行扩增和纯化后送到生物技术公司进行二代测序，得到测序结果后进行序列比对和分析。
三、结论
通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术，可以实现构建点突变质粒的目的。
本文介绍了具体的步骤和注意事项，希望能够对相关科研工作者提供一定的参考。
质粒点突变技术
质粒点突变技术：从原理到应用全面解析质粒点突变技术是分子生物学研究中常用的一种技术手段。
质粒点突变是指针对质粒中的一个或多个位点进行特定的改变，因此可以用来研究基因功能、蛋白质结构、信号转导、免疫调节等多个方面。
在本文中，我们将会从质粒点突变的基本原理开始，阐述质粒点突变的具体步骤和常见方法，并通过实例探讨质粒点突变在实验室中的应用。
首先，我们需要了解质粒点突变的基本原理。
质粒点突变可以通过多种方法进行实现，如撤除、插入、替换等。
这些操作都会改变质粒中某一位点的氨基酸序列，从而影响蛋白质的结构和功能。
由于生物体正常运转需要复杂的协同作用，单点突变往往可以引起基因表达、蛋白质活性等方面的变化。
在研究药物靶标、疾病机制、代谢通路等方面，质粒点突变技术都可以发挥重要作用。
具体地，质粒点突变需要经过以下步骤：1.设计点突变目标；2.合成突变引物；3.进行PCR反应；4.纯化PCR产物；5.用突变质粒构建大肠杆菌；6.筛选突变质粒；7.验证点突变效果。
其中，点突变目标的设计需要结合DNA序列以及蛋白质建模和序列比对等手段，合成突变引物则需要根据基因序列中的具体信息进行设计。
在实验室中，常见的质粒点突变方法包括 PCR突变法、限制性酶切法、自发突变法等。
PCR突变法是目前应用最广泛的突变技术，它能够在短时间内完成突变并且效率较高，但其需要添加较高浓度的引物和热稳定酶，容易出现扩增产物杂乱和酶切失效的情况。
而限制性酶切法是一种选择性突变方法，适合进行小段区域的突变，但是其扩增产物的长度往往较短，需要经过特殊的操作才能转化进入大肠杆菌进行筛选。
自发突变法是一种自然的基因突变方法，能够“随机”产生大量的突变体，但是其突变率低，突变类型也比较复杂。
因此，在具体操作的时候需要根据研究需求、样本和测量方法等要素进行选择。
最后，我们需要关注质粒点突变在实际应用中的一些注意事项。
首先，突变质粒的产生需要严格的质量控制，避免杂质的干扰。
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基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例
以G CG→A CG为例：
5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’
（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。
（3）重新调整引物长度。
Primer #1: 5’-CCT CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC GG-3’
Primer #2: 5’-CC GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG AGG-3’在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。
五、突变所用聚合酶及Buffer
引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。
可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTAR TM HS DNA polymerase。
六、如何去掉PCR产物
最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。
1. 设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导
2. 准备模板质粒DN A
[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。
在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。
提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。
3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng）2μl
Control primer mix（20pmol/μl）2μl
dNTP mixture（each 2.5mM）2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme1μl
4. 样品反应体系（50μl反应体系）
5. PCR反应条件
[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。
[B] 突变质粒选择
PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1. 准备PCR反应产物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。
因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。
如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。
1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。
2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。
序列分析
通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。