活体染色实验
实验目的
1、练习并掌握动物组织活体染色方法。 2、学习大鼠肠系膜铺片制作方法。 3、学习大鼠皮下结缔组织铺片制作方法。 4、了解大鼠肝脏石蜡切片制片方法，观察Kupffer 细胞。
实验原理
要显示巨噬细胞多采用活体染色法，即将一种对 动物无毒害或毒性很小的染料，用注射器注入动物体 的腹膜腔或血管内，体内有吞噬能力的细胞会将注入 的活体染料吞噬入细胞内。然后将动物杀死取材，经 固定、浸洗、复染、脱水、透明、封固等手续制成玻 片标本。
再用蒸馏水浸洗片刻，即可进行染色。也可直接进 入70%酒精中保存。 5、染色
固定好的铺片进行常规HE染色（详细过程见石 蜡切片制作介绍）。
注意：盐酸酒精分色要适度，过量会导致巨噬 细胞脱色。
活体染色法显示巨噬细胞
定义：活体染色(vital staining)一 般是指用无毒或毒性很小的染料,在不影响 细胞的正常生命活动的前提下而使活细胞 的某些结构着色的一种实验方法。
最早进行活体染色的是Paul Ehrlich (1885)他把刚切下的新鲜组织浸泡在亚甲 基蓝(美蓝)溶液中,再用显微镜来观察尚处 在生活状态下的活细胞结构。
活体染色一般选用的燃料有台盼蓝、中性红、锂 洋红、墨汁等。
实验材料与器材
实验动物：成年大白鼠
实验试剂与器材：1%台盼蓝染液，乙醚，福尔马林，
酒精（梯度），harris苏木精染液、曙红染液，二甲 苯，中性树胶；手术器械一套， 5ml注射器，载玻 片，盖玻片，卧式染缸，单面刀片。
实验步骤
1、活体注射 大白鼠麻醉、称重，按8ml每千克体重动物，注
射1%的台盼蓝溶液。每天注射一次，注射、取材 动物断头处死，取皮下结缔组织、肠系膜、肝脏或
大网膜为材料。取小块结缔组织或肠系膜，置于载玻片 上，用解剖针尽量将其铺平，干燥后浸入10%福尔马林 中固定。 3、固定
用10%福尔马林固定12—24h。
4、浸洗 用70%酒精浸洗数小时，中间更换数次新液，
实验 细胞内液泡系和线粒体的活体染色
1. 原理：中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色 范围 pH6.4～8.0之间（由红变黄）。其胶粒表面 带阳离子，被染部分具阴离子，它们彼此之间就 发生了电吸附作用（静电吸附）。
在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收 中性红并向液泡中排泌。由于液泡为酸性，因此进入液 泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色。原生 质和细胞壁一般不着色。
软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高 尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维 等，因而液泡系发达。
中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡 系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核 不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。
2. 健那绿(Janus green B)染液，原来也曾译为 詹纳斯绿B，是专一性染线粒体的活细胞染料，线 粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有 色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还 原，成为无色状态。因此可以使活细胞中的线粒体 呈现蓝绿色，而细胞质接近无色。线粒体能在健那 绿染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍 显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布。
死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液 泡内，用中性红染色不产生液泡着色现象；相反，中性 红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合， 而使原生质与细胞核带微红色 。
在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡 除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、 微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬 泡，都是由一层单位膜包围而成。这些细胞器几乎 每个细胞都有。
细胞内液泡系和线粒体 的活体染色
一、实验目的
1. 了解活体染色的定义及原理； 2. 熟悉液泡系和线粒体活体染色的方法
和步骤。
二、定义及原理
实验三 线粒体活体染色
油镜下小鼠骨髓细胞染色体
油镜下观察
染色体标本观察
线粒体活体染色
线粒体活体染色
线粒体电镜观察
A
C
M
C
N
M
线粒体电镜观察
C C C
N M
MV L
线粒体电镜观察
B M
M
N L
MV
MV
N
L
N
1、人口腔粘膜上皮细胞活体染色显示线粒体 （1）用消毒牙签刮取口腔粘膜细胞，用力应稍重些， 以便得到生活力教旺盛的细胞，将刮取物涂在载玻片 中央。 （2）滴1滴詹纳斯绿B染液于细胞涂片处，2~3分钟后 盖上盖玻片。 （3）用显微镜观察，在高倍镜下可见细胞质中散在一 些被染成亮绿色的短棒状和圆形颗粒，即为线粒体。
实验三 线粒体活体染色
线粒体活体染色
实验目的： 掌握线粒体活体染色的方法与原理
实验原理：
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。 活 体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而 又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线粒体的专一 性活体染色剂。呈碱性，具有脂溶性，能够穿过细胞膜进入细胞内，并 通过其结构中带有正电荷的染色基团结合到带负电荷的线粒体内膜上。 线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细 胞质中染料被还原，成为无色状态。
线粒体活体染色
活体染色：是使生活有机体的细胞或组织特异性着色， 但对该样本又没有毒害作用的一种染色方法。 目的：既显示活体细胞内的某些结构，又不影响细胞 的生命活动和产生任何物理和化学变化以致细胞的死亡。 应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形 态结构和细胞生理、病理状态
线粒体活体染色
实验二、活体染色
活染注意问题
1、染料使用浓度： 中性红体外一般1/1000－1/3000，动物注 射可达1％－2％ 健纳绿：1/3000－1/5000 2、配染液用溶剂 尽量接近观察材料生活环境的液体
（二）植物叶肉细胞线粒体染色及观查
1、取清洁载玻片（最好放在37℃恒温箱）， 滴2滴0.02％詹纳绿生理盐水液； 2、撕取小片植物叶下表皮，放入染液中压实； 3、染色10－15min； 4、加盖玻片，吸水纸吸去周围多余染液 5、观察叶肉细胞中线粒体的形态、大小及分 布
肝组织詹纳绿染色及肝细胞线粒体观察
实验仪器用品
普通光学显微镜 小剪刀 圆头牙签 载玻片与盖玻片 胶头吸管
实验操作
（一）口腔粘膜上皮细胞詹纳绿染色 1、取清洁载玻片（最好放在37℃恒温箱），滴2滴 0.02％詹纳绿生理盐水液； 2、用牙签钝头在自己口腔脸颊粘膜处用力刮取上皮 细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液中搅匀； 3、染色10－15min； 4、加盖玻片，吸水纸吸去周围多余染液 5、观察口腔粘膜上皮细胞及其中染成蓝绿色的线粒 体，画图示线粒体形态及分布
1、剪取肝边缘较薄处组织1小块，放在凹玻片凹槽中， 用生理盐水反复浸泡冲洗以除去血液； 2、将凹玻片放在37℃恒温葙（为什么？），滴2滴 1/5000健那绿生理盐水液，注意不可将组织完全 淹没，使组织边缘染成蓝绿色即可，一般需2剖剪剪取 组织块边缘着色部位，放入生理盐水中，剪碎后压 片观察，画图示肝细胞及其中线粒体形态、分布。
活体染色常用染料
詹纳绿－线粒体（体外活染） 亮焦油紫－线粒体（体内活染） 中性红－液泡系（体内体外兼可） 次甲蓝－神经组织 尼罗蓝（Nile Blue）－原生动物大核
实验目的
了解常用活体染色剂及使用方法 通过活体染色了解细胞的结构和功能
实验一 植物细胞的活体染色与死活鉴定
实验一植物细胞的活体染色与死活鉴定一、实验原理：1、活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。
2、中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4~8.0之间（由红变黄）。
在酸性条件下中性红解离度很强，带色的阳离子呈樱桃红色，在pH7以上，它不解离而以分子态溶于水呈橙黄色的溶液。
3、染色（1）即使是显微镜有足够的分辨率和合适的放大倍数，未经染色的组织切片或涂片常常不能直接在光镜下观察，其原因主要是标本各部分结构对光的折射率没有显著的差别。
染色则是通过改变标本各部分之间对光的折射率，使其可以在光镜下观察。
（2）在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应。
因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内。
因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。
相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。
二、仪器与用具：显微镜；载玻片；盖玻片；单面刀片；尖头镊子；酒精灯；火柴；吸水纸适量。
三、试剂：0.03%中性红溶液；1mol/L硝酸钾溶液四、实验步骤：1、切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，将制好的洋葱鳞茎内表皮放置于滴加蒸馏水的载玻片上，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察（注意调节光线强度）2、另取一小块表皮，滴加0.03%的中性红溶液，染色5~10min；在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察。
3、将步骤2中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10~15min，再置于载玻片上镜检（为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1mol/L 的硝酸钾溶液中浸泡10min左右，然后取出观察。
实验一 线粒体的超活染色
实验一线粒体的活体染色与观察一、实验目的1．观察动物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
2．学习一些细胞器的活体染色技术。
二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。
一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿B（Janus green B）是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。
三、实验仪器、材料和试剂1．仪器：显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、。
动植物细胞的活体染色
观察：
淋巴细胞：细胞中线粒体着色明显 粒细胞：细胞中液泡系着色明显 单核细胞：线粒体及液泡系均着色明显 观察白细胞的阿米巴运动（以多幅图描述动态过程） 观察中性粒细胞中的布朗运动 观察成垛的红细胞（缗钱状形态）
×
实验结果（部分）
黑色箭头所指为嗜中性粒细胞
黑色箭头所指为淋巴细胞
白细胞的阿米巴运动：请以多幅图表示运动过程（必画）
中性粒细胞中的布朗运动：绘制轨迹或文字描述
整理
显微镜复原
镊子、小烧杯等物品清洗后，请放回托盘中晾 干；请将托盘整理干净；
加过镜油、涂过凡士林膏的盖玻片丢弃，载玻 片用洗涤剂洗干净后集中放置（最后一条实验台 上的玻片回收缸）。
材料：新鲜血液 试剂：健那氏绿迅速取出，沥掉多 余的染液后风干。
取一干净盖玻片，四周涂上凡士林。 取一滴血滴于盖玻片涂有凡士林的一面上。 将盖玻片置于载玻片上，轻压使盖玻片和载玻片 之间形成一层薄而均匀的血膜。（注：镜下观察）
血细胞的活体染色
细胞活体染色
实验原理
活体染色
染液
健那氏绿 中性红
植物细胞的活体染色
材料：黄豆根尖、洋葱鳞片 试剂：中性红染液 步骤：
在载玻片上滴加一滴染液，将材料浸入染液中， 染色若干分钟。
弃掉染液，以蒸馏水漂洗。 盖上盖玻片，用吸水纸将多余水渍吸干。 观察液泡并绘图。
实验结果（部分）
小液泡
血细胞的活体染色
实验结果（部分）
实验结果（部分）
实验报告要求
将所观察到的细胞（或结构）绘图并描述其形态特点
植物细胞：绘制一幅分生区细胞图（示初生液泡），伸长 区、根毛区细胞以及洋葱表皮细胞内液泡的特点及染色情 况请以文字描述，并分析造成不同细胞内液泡着色差异的 原因。（必画）
实验三 线粒体活体染色
线粒体活体染色
活体染色：是使生活有机体的细胞或组织特异性着色， 但对该样本又没有毒害作用的一种染色方法。 目的：既显示活体细胞内的某些结构，又不影响细胞 的生命活动和产生任何物理和化学变化以致细胞的死亡。 应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形 态结构和细胞生理、病理状态
线粒体活体染色
3. 加至5ml低渗液，吹打后将离心管置37℃水浴中低渗 20min。
染色体标本制备
4. 1000r／min离心8min。，弃上清液。 5. 固定：加入新配制的甲醇：冰醋酸(3：1)固定液5ml，
立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。 （如此反复固定2～3次，每次20min。） 6. 滴片：固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，加入
油镜下小鼠骨髓细胞染色体
油镜下观察
染色体标本观察
线粒体活体染色
线粒体活体染色
线粒体电镜观察
A
C
M
C
N
M
线粒体电镜观察
C C C
N M
MV L
线粒体电镜观察
B M
M
N L
MV
MV
N
L
N
染色体标本制备
实验仪器、用具
天平 离心机 温箱 显微镜 酒精灯
注射器 解剖盘 解剖剪 刀片 离心管 吸管 烧杯 冰冻载玻片
骨髓细胞染色体标本制备
1. 秋水仙素处理动物：按4μg/g体重的剂量经腹腔注 射秋水仙素，3～4h后杀死动物。
2. 取骨髓取出动物后肢的股骨，剪去两端骨骺。 用注射器吸取2ml 0.075M KCl溶液注入骨髓腔，将 骨髓细胞冲入离心管中，用吸管反复吸打骨髓细胞， 使细胞团块分散。
线粒体的活体染色
不同细胞中线粒体的形态和数目不同; 在电子显微镜下 ;线粒体的外形多样;如圆形 椭圆形 哑铃形和杆状; 线粒体 的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关;线粒体多聚集 在细胞生理功能旺盛的区域;
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的; 一般与线粒 体长轴垂直排列;但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊; 脊的横切面呈囊状或管状; 脊的数量与细胞呼吸机能的强 度有很大关系;
2 在干净的平皿中;滴加1/5000詹纳斯绿B溶液;再将肝组织 块移入染液;注意不可将组织块完全淹没;要使组织块上面 部分半露在染液外;这样细胞内的线粒体酶系可充分得到 氧化;易被染色; 当组织块边缘被染成蓝绿色即成一般需染 20～30min;
3 吸去染液;滴加Ringer 溶液;用眼科剪将组织块着色部分 剪碎;使细胞或细胞群散出; 然后;用吸管吸取分离出的细 胞悬液;滴一滴在载玻片上;盖上盖玻片进行观察;
二 线粒体的活体染色与观察
1 人口腔上皮细胞线粒体的超活染色观察 1取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上;滴两滴
1/5000詹纳斯绿B染液;
2实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮 细胞;将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中;染色 10—15分钟注意不可使染液干燥;必要时可再加滴染液; 盖上盖玻片;用吸水纸吸去四周溢出的染液;置显微镜下 观察;
实验二 线粒体的活体染色
一 实验目的：
1 观察动物活细胞内线粒体的形态 数量与分 布;
2 掌握线粒体的活体染色原理及方法; 3 小鼠肝脏细胞线粒体染色及观察;
二 实验原理：
线粒体是细胞内一种重要细胞器;是细胞进行呼吸作用 的场所; 细胞的各项活动所需要的能量;主要是通过线粒体 呼吸作用来提供的; 活体染色是应用无毒或毒性较小的染 色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命 活动的一种染色方法; 詹纳斯绿 BJanus green B是线粒体 的专一性活体染色剂; 线粒体中细胞色素氧化酶系使染料 保持氧化状态呈蓝绿色;而在周围的细胞质中染料被还原; 成为无色状态;
线粒体及液泡系的活体染色
线粒体及液泡系的活体染色一、实验目的掌握动、植物细胞活体染色的原理和技术。
掌握各种染料的染色原理。
使我们对细胞中的线粒体及液泡系有一定的了解。
二、实验原理a)活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害或毒性很小的一种染色方法。
它的目的是在保持细胞活性的前提下，显示细胞内的某些特定结构。
b)线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随物种、组织器官和生理状态的不同而发生变化。
健纳绿可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
c)中性红为弱碱性染料，对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
d)亮焦油紫可用于活体染色，中性红用于染液泡系，健纳绿用于线粒体染色，次甲基蓝可用于染神经组织，尼罗蓝可用于染原生动物的大核。
三、实验试剂及器材a)实验试剂i.0.04%中性红生理盐水溶液：先配成1%中性红水溶液，再用0.65%氯化钠溶液将1%中性红水溶液稀释成0.04%溶液，盛于棕色瓶中，暗处保存。
ii.0.02%健纳绿生理盐水溶液：先配成1%健纳绿水溶液，再用0.9%氯化钠将1%健纳绿水溶液稀释成0.02%溶液，盛于棕色瓶中，暗处保存。
b)实验器材青菜叶、人口腔黏膜上皮细胞、载玻片、盖玻片、牙签、普通光学显微镜、刀片四、实验步骤a)口腔黏膜上皮细胞线粒体的染色观察i.取清洁载玻片，滴2滴0.02%健纳绿生理盐水溶液。
ii.用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中，搅匀。
（注意事项：应稍用力刮取口腔颊粘膜处上皮细胞，否则无活细胞染色不能成功。
）iii.染色10－l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)。
iv.盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察，拍照。
细胞活体染色技术
吸出染液，滴加Ringer氏液，盖片、镜检，注意观察线粒体分布及所呈形 状。
2. 用动物细胞观察线粒体的活体染色。 取鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入盛有Ringer氏液的表面皿中洗去血
液。
将肝组织洗净后吸去血液，加入1／5000詹纳斯绿B染液染色30分钟，注 意不可将组织块完全淹没。
2. 在载玻片中央滴加中性红染料。使材料在其中染色5一10分钟。 3. 吸去染料，滴加Ringer氏液一滴，盖片、镜检、注意液泡系染成什么颜色，其形态、大小如何、分布
位置。
线料体的活体染色
1. l、用植物细胞观察线粒体的活体染色 用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块(约lcm2)，放在载玻片上用1/5000詹
一．取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1 ／5000詹纳斯绿B溶液。
二．用牙签取口腔上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的 染液滴中，染色10一15分钟(注意不能干燥)，盖上盖片， 吸去多余的溶液，即可镜检。
三．台盼蓝染色鏊别死活细胞。
○ 抽取小鼠腹腔水细胞涂于洁净载玻片上，滴加l％台盼蓝1滴， 盖上盖玻片于显微镜下观察。
实验三、细胞活体染色 技术
一、实验目的
学习细胞活体染色的方法。 观察动、植物活细胞内线粒体，
液泡系的形态、数量与分布。
二、实验原理
一．活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂，在不影响细胞生命活动的情况下显示细胞的天 然构造，更具真实性。活性染色又分为体内活体染色和体外活体染色。 二．詹纳斯绿B是一种活体染色剂，专一用于线粒体的染色并且呈现染成蓝色。它可以和线粒体中 的细胞色素C氧化酶结合，从而出现蓝绿色。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色 状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态。必须指出B氧化，从而使它显出颜色，因此，在实验过程中务必保持所取的 材料的活性。通常，需要把生物材料置于０℃～４℃的冰水浴低温中，并且操作要迅速。