Southern 印迹杂交实验报告
实验七Southern印迹法
实验七Southern印迹法Southern印迹法是分子生物学中常用的 DNA 转移与杂交技术。
Southern印迹法的目的是分离 DNA 片段，并根据它们的长度和数量测定第一种样品中特定 DNA 片段的存在。
该方法是以 Edward M. Southern 1975 年提出的。
Southern印迹法是一种将 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上的技术。
该方法的基本原理是将目标 DNA 的片段分离出来，通过凝胶电泳分离出 DNA 后，将它转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
转移后进行 DNA 与膜的固定和预处理，然后涂上 DNA 探针发现和显示 DNA 片段的方法。
这些探针经常是标记的核酸分子，它们与目标 DNA 片段杂合并可以通过荧光或放射性探测器进行检测。
1. DNA 片段的制备从需要研究的DNA中，通过限制酶切或PCR扩增等方法，将所需 DNA 片段制备出来。
2. 电泳用琼脂糖电泳分离DNA片段，根据分子大小排列。
3. 转移将分离出的 DNA 片段转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
4. 增强和固定增强和固定DNA与膜之间的结合力，以便进行杂交。
5. 杂交将贴有 DNA 片段的膜和DNA探针，一起置于一定的条件下进行杂交，以检测特定的DNA 片段是否存在。
6. 洗涤和显影通过洗涤和显影等操作，观察到探针与 DNA 片段的杂交情况，以得到所需的信息。
Southern印迹法在生物学领域中的应用广泛。
它被广泛用于研究 DNA 片段，如发现基因缺失、揭示癌症的起源等方面的研究。
此外，它还可以用于检测利用基因工程技术制造的 DNA 片段与细胞内的核酸结合情况。
总之，Southern印迹法是一种常用的 DNA 分析方法，它可以用于很多领域，比如基因工程、细胞生物学、药物研究和疾病诊断等。
该方法分离DNA 片段的能力和灵敏度高，可以对 DNA 片段进行量化，是分子生物学中不可或缺的重要技术手段。
Southern印迹杂交实验服务
Southern印迹杂交实验服务原理Southern 印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法。
其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
【晶莱生物】实验流程1、制备待测DNA2、DNA限制酶消化3、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品4、电泳凝胶预处理5、转膜6、探针标记7、预杂交8、Southern杂交9、洗膜10、放射性自显影检测11、实验结果分析及报告客户提供1、待杂交目标基因序列和含有待杂交基因的阳性质粒（如自带引物，请提供引物：100umol/ul，〉10ul,冰袋运输）。
2、待杂交的高质量DNA样品质量至关重要，决定实验的成败，请确保DNA抽提质量，尽量采用进口试剂盒提取,A、基因组DNA检测：OD260/OD280=1.8-2.0，基因组要求DNA总量不小于10ug，浓度大于200ng/ul；B、请提供基因组DNA检测图片，要求无降解，无蛋白污染；C、检测样品低温运输至公司，或交给当地的业务员或代理商处理3、客户如果无法提供高品质的基因组DNA样品，本公司可以帮助制备可用于Southern Blot 检测的DNA样品，客户提供样品要求如下：A、菌液：不低于500ul，冰袋或者干冰运输B、组织：总量不小于100mg，干冰运输C、细胞：提供新鲜的细胞即可，尽量不要使用盐溶液冲洗4、请注明基因组DNA酶切方案，如果项目中需要用到非常规的限制性内切酶，需额外加收酶切费用或有客户提供相应的限制性内切酶。
终产品1、DNA样品检测报告（实验样品不返还，请注意保留备份）2、标准实验流程报告3、southern blot实验结果检测报告做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，勤劳的蜜蜂有糖吃细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、核心期刊等服务。
Southern杂交方法
分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。
膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。
再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。
最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。
由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。
Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。
Southern 印迹杂交实验报告
Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
【实验步骤】1、基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。
老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。
总体积20μL。
37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。
浇板，水平放置，待凝。
胶凝后按照以下顺序加样。
两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）②基因组DNA10 μg（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)⑤酶切样品⑥基因组DNA10 μg （老师的）⑦基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
southern 印迹法
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
southern bloting
Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。
用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。
将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA 转移至一固相支持滤膜。
利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA 发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20╳SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M 马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。
（三）步骤：1、酶切（以单一酶为例）设置反应体系（反应体系30μl）ddH2O 5μl 基因组DNA（0.5μg/μl）2μl短暂离心，消除离心管内气泡，于37℃消化过夜注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
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Southern 印迹杂交实验报告
姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生
实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤
【实验目的】
学习核酸杂交的基本过程和操作
【实验原理】
将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
【实验步骤】
1、基因组DNA的限制性内切酶酶切
取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。
老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。
总体积20μL。
37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳
先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。
浇板，水平放置，待凝。
胶凝后按照以下顺序加样。
两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）
②基因组DNA10 μg（老师的）
③酶切样品
④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)
⑤酶切样品
⑥基因组DNA10 μg （老师的）
⑦基因组DNA10 20μl （自己的）
插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
3、变性
切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺）
①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。
②ddH2O洗2次。
③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
4、转移
①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。
②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。
③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。
④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的
滤纸，赶走气泡。
⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。
⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。
保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。
⑦用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。
取走滤纸上的
保鲜膜。
⑧整齐地放上草纸，数张草纸一折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10 cm。
⑨在草纸上放上玻璃板, 压上约500 g重的重物, 转移过夜。
5、固定
①将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置。
②正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。
6、杂交和洗膜
①将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 68℃封闭6小时。
②倒出预杂交液, 加杂交液，68℃杂交过夜。
③回收杂交液（可重复使用），将膜放在洗膜溶液I（2xSSC,0.1%SDS）中, 室温洗2次, 每次摇动5分钟。
④再在洗膜溶液II（0.5xSSC, 0.1%SDS）中, 68℃洗2次, 每次摇动15分钟。
7、检测
①将膜在缓冲液1(马来酸缓冲液)中漂洗3分钟。
②在缓冲液2（封闭液）中室温摇动封闭30分钟。
③在含anti-DIG-AP的抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。
④用洗膜溶液III（马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次, 每次15分钟。
⑤在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。
⑥将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时。
⑦当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE或ddH2O洗去底物液，拍照并干
燥保存。
【实验结果】
上面两张图分别为琼脂糖凝胶电泳结果和Southern blot结果，琼脂糖凝胶电泳结果显示1-3条带（基因组DNA自己的；基因组DNA老师的；酶切样品）均有DNA片段显示，4阳性对照对应条带无DNA片段显示，1、2条带因为基因组很大，在电场作用下基本不会动，故在靠近加样孔的地方；而酶切后的基因组由于断裂成一系列的片段，电泳时会形成均匀的涂抹状，见条带3；尾巴高亮怀疑是RNA量过多；Southern blot 只显示了阳性对照结果。
【注意事项】
1、DNA限制性酶的用量1-5U/ugDNA，时间为1-20小时。
中途可取少量（小于十分之一）电泳检测是否酶切完全。
2、EDTA会抑制酶活性，在酶解反应液中的浓度小于0.25mmol/l为佳。
3、内切酶一般保存在甘油中，甘油会抑制酶活性，因此，所加入酶的体积应小于反应总体积的十分之一，否则应将反应体积加大。
4、若基因组DNA浓度低，可在酶切后用一冲成点浓缩DNA后跑胶。
5、标记探针在加入杂交液之前，一定要加热变性处理，并且要先在杂交液中混匀后加入，不要直接加在膜上。
6、杂交也可以在杂交袋中进行。
7、含有DIG标记探针的杂交液可以放在-20°C保存，反复多次使用，每次用前在68°C热变性。
8、为了获得最佳效果，第一次使用的探针，可做系列模拟杂交，即将小块尼龙膜在不同探针浓度的杂交液中杂交过夜，然后经显色检测，采用背景可以接受的最高的探针浓度进行真实杂交。
9、第一次杂交的DNA可用碱去除探针（限于尼龙膜），用第二个探针做预杂交和杂交。
10、杂交的灵敏度取决于杂交液中探针的弄得和显色时间。
11、对于尼龙膜可采用碱溶液转移，更有利于DNA的结合。
12、若目的片段大于10kb可用0.25mol/lHCl先部分脱嘌呤，使片段变短，便于有效转移。
【讨论】
●结果分析
本实验凝胶电泳后，紫外灯下观察1-3条带均有DNA片段显示，4阳性对照对应条带无DNA片段显示。
转膜结果中只有阳性对照组有杂交后显色，可能原因有：①本实验采用毛细管法向上转移，可能是由于转膜速度慢、效率低导致的转膜不完全，使DNA含量非常少，以至于无法抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色；②DNA含量过少，非放射性标记探针法灵敏度不高，可以试用放射性探针标记法提高灵敏度；③预杂交液封闭非特异性结合位点时也结合了含量很低的待测DNA位点，可以尝试用不同浓度的预杂交液来封闭非特异性位点；④洗膜条件有：低严格度（低温、高盐）、高严格度（高温、低盐），随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以洗膜时一定要按照低严格度→高严格度，可以减少DNA的流失。
●影响杂交的因素：
1、待检核酸分子的浓度和长度，浓度越大，复性速度越快，敏感性越高；分子越大，转膜越困难，敏感性下降。
2、探针的性质（标记效率、浓度，核酸性质）：对于单链探针，浓度越高，杂交率增加；探针标记方法和检测方法的选择。
进行探针标记的标记物分两大类：放射性和非放射性。
放射性标记物的灵敏度极高，可检测到10-14—10-18g的物质，在最适条件下，可检测出样品中少于1000个分子的核酸含量，但是存在着放射性污染及放射核素发生衰变所产生的不稳定性两大缺点。
非放射性标记物（生物素、地高辛、荧光物质、酶类、金属Hg等）优点是无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放等。
本实验采用地高辛连接于dUTP上进行标记，地高辛标记的探针与靶核酸杂交后，用带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行免疫结合反应，通过酶底物的化学显色来显示。
与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可以长期保存。
与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。
3、杂交液体积、温度和杂交时间：体积越小，杂交动力学越高；DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃；温度↓非特异性↑；温度↑敏感性↓。
4、杂交液的离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的杂交时，必须维持
杂交液与洗膜液中较高的盐浓度。
5、非特异性杂交反应：预杂交的作用，杂交前封闭膜上非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异吸附。
常用的封闭物：①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA，②高分子化合物：脱脂奶粉等。
6、杂交后的漂洗：盐浓度、温度、次数，体积；漂洗从低严谨度（低温高盐）→高严谨度（高温低盐）。
7、固相膜的选择：阳离子尼龙膜。
8、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42°C。
使用甲酰胺的优点：低温下探针更稳定，能更好地保留非共价结合的核酸。