引物设计常见问题
引物合成常见问题分析
引物合成常见问题分析引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。
因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。
所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。
如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。
取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2.如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。
一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp 的引物使用12% 的凝胶。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用银染方式染色。
3.使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用Agarose 电泳来进行定量了）。
引物设计知识点总结
引物设计知识点总结引物是在分子生物学和遗传学研究中广泛使用的一种技术。
它主要用于DNA或RNA的扩增、测序和检测等实验。
引物设计的质量和准确性对实验结果有着重要的影响。
本文将对引物设计的知识点进行总结和讨论。
一、引物设计的基本原则引物设计需要考虑以下几个基本原则：1. 引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间。
过短的引物可能导致扩增效率低下，过长的引物则可能增加非特异性扩增的风险。
2. 引物温度：引物的熔解温度（Tm）应在50-65摄氏度之间。
引物的Tm过高可能导致非特异性扩增，而过低则可能导致扩增效率下降。
3. 引物结构：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的3'端应尽量避免含有GC丰富序列，以减少引物自身的二聚体形成。
二、引物序列的选择在引物设计中，需要根据具体的实验目的和DNA序列来选择引物的序列。
以下是常见的引物序列选择策略：1. 引物长度：引物的长度一般为18-30个碱基对。
对于较短的DNA序列或需要快速扩增的实验，可以选择较短的引物；对于复杂的基因或需要高度特异性扩增的实验，可以选择较长的引物。
2. 引物位置：引物应位于目标序列的末端，以提高特异性。
通常，引物应位于目标序列的保守区域，并避免位于变异或多态性较高的区域。
3. 引物序列：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的GC含量应适中，避免过高或过低。
三、引物设计工具为了帮助科研人员进行引物设计，许多在线工具和软件被开发出来。
以下是一些常用的引物设计工具：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计工具，可以根据用户输入的序列和参数，自动设计引物。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST可以在设计引物的同时，对引物与目标序列的特异性进行评估。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer可以评估引物的物理属性，如熔解温度和GC含量，并检查引物是否存在二聚体结构。
引物设计的要点
引物设计的要点学习引物设计这么久，今天来说说关键要点。
我理解引物设计首先得保证特异性。
这就好比你要在一堆钥匙里找到一把能开特定锁的，引物得专门针对你要扩增的那段DNA才行。
比如说我之前做实验要扩增一个植物的特定基因，如果引物特异性不好，可能就会结合到其他相似的基因序列上，那得到的结果就完全不是自己想要的了。
怎么保证特异性呢？我总结就是要在公共数据库里好好查一查你要扩增序列的信息，看看有没有相似的序列，尽量避免引物和其他非目标序列结合。
然后就是引物的长度。
引物不能太长也不能太短。
我理解如果太短的话，特异性就差，就像你给的这个识别信息很短，很容易就找到很多相似的对象。
如果太长的话成本就高而且也可能出现一些不必要的反应。
一般来说18 - 25个核苷酸是比较合适的范围。
比如说我参考一些前人在相似基因上设计的引物的时候，发现大多数成功的引物长度都在这个范围内。
对了还有个要点就是引物的GC含量。
我之前老是记错这个GC含量的要求范围。
我理解GC含量得适中，大概在40% - 60%左右。
GC之间有三个氢键连接，AT之间是两个氢键连接，如果GC含量太高或者太低都会影响引物的退火温度，进而影响整个扩增反应。
就好像一群人配合做事情，如果一种人太多或者太少都不利于工作的正常开展。
我之前有个实验设计引物的时候没太注意GC含量，结果反应总是失败，后来仔细调整了GC含量之后反应就顺利多了。
退火温度也很重要。
这得根据引物的长度、GC含量等来计算。
我理解退火温度得适宜，太高了引物不能很好地和模板结合，太低了又会出现非特异性结合。
我通常会先根据公式大概计算一个退火温度范围，然后进行梯度PCR来找到最适合的退火温度。
在学习引物设计的过程中我也有很多困惑。
比如有的时候我按照这些要点去设计引物，但是实验结果还是不理想。
我分析原因可能有很多，可能是模板本身有杂质，也可能是PCR体系中其他成分的影响。
这时候就不能光从引物设计上找问题，还得全面考查整个实验体系。
高中生物学pcr技术中引物相关问题归类分
高中生物学pcr技术中引物相关问题归类分一、引物特异性问题引物特异性是PCR技术中的关键问题之一，它直接影响到PCR 产物的数量和纯度。
引物特异性主要取决于其与模板序列的匹配程度。
以下是一些引物特异性相关问题：1. 引物长度和碱基组成：引物长度和碱基组成对引物特异性有一定影响。
一般来说，引物长度适中，不宜过长或过短。
碱基组成上，避免使用GC含量过高或AT含量过低的引物，以免影响引物的稳定性。
2. 模板序列变化：模板序列中任何微小的变化都可能导致引物与模板的错配，从而影响PCR产物的数量和纯度。
因此，在设计和选择引物时，应仔细考虑模板序列的变化，确保引物与模板序列的匹配度。
3. 酶切位点的干扰：如果模板序列中含有酶切位点，则需要注意酶切位点对引物特异性的影响。
在设计引物时，应避免将酶切位点设计在引物自身或与其互补的序列中，以减少错配的可能性。
二、引物自身互补问题PCR过程中，引物自身互补也是常见的问题之一。
引物在退火过程中可能会发生自身互补，从而导致非特异性产物的产生。
以下是一些关于引物自身互补的相关问题：1. 引物浓度和退火温度：引物浓度和退火温度是影响引物自身互补的重要因素。
降低引物浓度或提高退火温度可以减少引物自身互补的可能性。
2. 引物长度和碱基组成：引物长度和碱基组成也会影响引物自身互补的可能性。
选择适当的引物长度和碱基组成，可以提高引物的稳定性，减少自身互补的发生。
三、其他相关问题1. Mg2+浓度的影响：Mg2+浓度是PCR过程中的关键因素之一。
过高或过低的Mg2+浓度都可能导致PCR产物的数量和纯度受到影响。
在设计和优化PCR反应体系时，应注意Mg2+浓度的选择。
2. 延伸温度的选择：PCR产物延伸温度也是影响PCR产物的数量和纯度的因素之一。
选择适当的延伸温度可以减少非特异性产物的产生，提高PCR产物的纯度。
总之，在高中生物学PCR技术中，引物特异性、引物自身互补和其他相关问题是需要关注和解决的。
引物设计知识点归纳总结
引物设计知识点归纳总结引物设计是生物学和生物技术领域中非常重要的一个环节。
在分子生物学研究、基因工程、医学诊断、疾病预防等方面，引物设计都起着至关重要的作用。
引物设计的好坏直接影响到PCR扩增、序列特异性分析、RNA干扰、原位杂交、基因克隆等实验的效果和结果。
因此，深入理解引物设计的相关知识点对于提高实验效率和结果的可靠性非常重要。
本文将介绍引物设计的相关知识点，并对其进行归纳总结。
1. 引物设计的基本原则引物是在分子生物学实验中用于对特定DNA或RNA序列进行扩增、检测或特异性结合的人工合成的寡核苷酸序列。
设计好的引物对于实验的成功至关重要，而引物设计的基本原则包括：(1) 引物长度：引物长度一般在18-25碱基对之间，过短的引物可能导致扩增效率低，而过长的引物可能导致特异性差。
(2) GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物的结合性能和特异性。
(3) 引物序列选择：引物的序列选择要尽量避免重复序列、近似重复序列和具有高度变异性的区域。
(4) 引物特异性：引物的特异性是指引物能够与目标序列特异性结合，而不结合其他非特异序列，引物特异性的好坏直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
2. 引物设计的常见问题及解决方法在引物设计过程中，常常会遇到一些常见问题，例如引物特异性不足、引物二聚体形成、引物偏向性扩增等问题。
针对这些问题，有一些解决方法可以参考：(1) 引物特异性不足：可以通过生物信息软件对引物进行预测和评估，合理选择引物序列，避免与非特异序列发生交叉杂交。
(2) 引物二聚体形成：引物二聚体是指引物之间相互结合形成二聚体，导致引物的扩增效率降低。
可以通过调整引物长度和序列，以及优化PCR扩增条件来避免引物二聚体的形成。
(3) 引物偏向性扩增：引物偏向性扩增是指引物对特定序列的扩增效率高于其他序列，可以通过优化PCR扩增条件，如调整引物浓度、反应体系等来解决。
基因引物设计的注意事项
基因引物设计的注意事项
1. 嘿，一定要注意引物的特异性啊！就好比你去参加一个聚会，可不能找错了对象，得找到那个独一无二的才行啊！比如说设计针对某个特定基因的引物，要是特异性不强，那不就跟在一堆人里瞎找一样嘛，那可不行！
2. 还有哦，引物的长度也很关键呀！太短了就像小矮人一样没啥力气，太长了又会变得很笨拙。
就像挑扁担，太短挑不起来，太长又不好掌控。
比如设计一个合适长度的引物，才能发挥出最佳效果呀！
3. 千万别忽视引物的退火温度哦！这就像是给菜调味一样，温度不合适，味道就不对啦！比如在某个实验中，如果退火温度不合适，那结果可能就一塌糊涂咯！
4. 哎呀呀，要考虑引物之间的互补性呀！可别让它们自己就黏糊到一块儿去了。
这就跟两个人老在那腻歪，不好好干活一样。
像如果引物之间互补过度，那还怎么好好进行实验呢！
5. 要注意引物不能有二级结构呀！要是有了，那可不就像路中间有个大石头一样挡路嘛。
比如说一个设计不当有二级结构的引物，肯定会影响反应的进行啦！
6. 你知道吗，引物的 GC 含量也不能马虎！这就像做饭盐放多放少一样重要。
要是 GC 含量不合适，那实验可能就搞砸啦！就像某次实验，因为引物的GC 含量没把握好，结果就不尽如人意呀！
7. 最后啊，一定要多检查几遍引物的设计呀！这就和出门前照镜子一样，要反复确认没问题才行。
你可不想因为引物设计有漏洞而导致一切努力白费吧！所以，一定要认真对待基因引物设计的这些注意事项哦！
我的观点结论就是：基因引物设计的这些注意事项真的超级重要呀，每个环节都要用心去对待，这样才能得到满意的结果呀！。
荧光定量PCR技术的使用中常见问题
荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。
然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。
一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。
引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。
引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。
- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。
- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。
- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。
2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。
这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。
二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。
选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。
TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。
2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。
以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。
- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。
三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。
其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。
引物注意事项
引物注意事项引物是分子生物学和遗传学研究中常用的一种技术工具，它们通常用于PCR、测序、杂交等实验中。
选择合适的引物对于实验结果的准确性以及实验效率都有着非常重要的影响。
因此，在使用引物时，需要注意以下几点事项：1. 引物设计：在选择引物时，需要根据所需扩增的目标基因序列来设计引物。
引物应该具有较高的特异性，即只与目标基因序列特异性结合，而不与其他非特异性序列结合。
同时，引物的长度和GC含量也需要根据实验需要进行合理设计，一般引物长度在18-25个碱基对之间，GC含量在40%-60%之间比较适合。
2. 引物纯度：引物的纯度对扩增反应的效果有着直接的影响。
在购买引物时，需要选择质量可靠的生产商，并确认引物的纯度和质量，并进行必要的质检，确保引物的质量符合实验要求。
另外，在实验中使用引物前，也需要对引物进行适当的纯化处理，以确保引物的纯度。
3. 引物浓度：在实验操作中，需要根据实验要求调配合适浓度的引物溶液。
一般情况下，引物的浓度在10-100μM之间比较适合。
引物的浓度过高或过低都会影响PCR扩增的效果，因此需要根据实验需要进行合理的调整。
4. 引物储存：引物的储存条件对于引物的稳定性和活性有着重要的影响。
一般情况下，引物需要保存在干燥、阴凉、避光的条件下，避免长时间暴露在高温、阳光下。
另外，在制备引物溶液时，也需要避免多次冻融，以保证引物的稳定性。
5. 引物使用量：在实验中使用引物时，需要根据实验要求合理确定引物的使用量。
一般情况下，引物的使用量会影响到扩增效果和实验成本，因此需要在实验前对引物的使用量进行合理估计和计算，以确保实验的顺利进行。
6. 引物的合成：在一些特殊实验中，有时需要对引物进行修饰或合成，以满足实验的特殊要求。
在这种情况下，需要选择合适的引物合成技术和合成商，确保引物合成的质量和效果达到实验要求。
总之，引物在分子生物学和遗传学研究中起着非常重要的作用，选择合适的引物并注意引物的质量、纯度、浓度、储存和使用等方面的事项，对于实验结果的准确性和稳定性有着重要的影响，因此在使用引物时需要特别注意以上事项，以确保实验的顺利进行和结果的准确性。
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引物设计常见问题与解答(二)17. 长链引物为什么出错的几率非常高答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。
引物链越长，突变的频率累加起来就越高。
研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。
但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。
要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。
做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
18. 如果测序发现突变，该如何处理答：对您遇到的困惑，我们表示同情。
遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。
如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。
根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。
一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。
您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。
基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿答：没有。
我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。
原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。
20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。
但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。
国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。
建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。
21. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高答：有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。
问题来了，还有那30%是什么引物纯化PAGE, 需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。
沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰引物的使用。
OPC纯化也类似的情况。
即使是HPLC纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。
22. 为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高答：主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。
修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。
修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么答：下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer .◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆在引物的5‘端避免使用G.◆选用比较多的碱基C.◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。
有用的荧光染料参数24. Primer设计的基本原则是什么答：引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer.◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3‘端最后5个碱基有2个以上的G或C.◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A.◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
25. 用软件设计的引物为什么不管用答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。
引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。
不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。
其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。
软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。
有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。
26. 为什么引物的OD260/OD280小于答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。
投诉者有时心情很不好，还不听解释。
撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。
OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。
下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD 280的比值与引物的碱基组成密切相关。
27. 同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量（如质粒DNA），因为EB可以嵌合到双链DNA 中。
而合成的单链DNA,由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo（dT）等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。
所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。
同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。
28. 引物不纯会有什么后果答：引物不纯可能会导致：1）非特异性扩增；2）无法用预先设计在引物5‘端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3）用于测序出现双峰或乱峰。
解决办法重新合成或重新纯化。
29. 为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来答：有些PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好。
要求我们重合，没有问题。
可是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。
这种情况的出现一般都是用户自己的原因。
对于引物合成，我们只能做到合成的引物没有问题，至于您是否能够扩增出来您需要的产物，那得靠您自己对实验本身的理解和把握。
我们不能杜绝我们不犯错误，但是引物合成犯同样错误的几率很小，想犯同样的错误都难。
PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。
如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。
如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留存样品。
如不明原因，我们免费为您重新合成一次。
如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。
30. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了答：如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。
使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。
建议分装引物，避免反复冻溶。
建议使用10mM Tris 缓冲液溶解引物，因为因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5），引物在这种条件下不稳定。
还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
31. 引物质量好坏的判断标准是什么答：合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。
32. 引物是我们设计的，现在您扩不出来，我们要负责吗答：不负责任。
我们免费为一些实验经验不足的人员，免费设计引物。
引物设计好，我们都会发给您确认。
设计引物时我们遵循一般的指导原则，但是设计的引物是否能够满足您的实验要求，扩增出您需要的基因片段，我们就不能保证了。
我们遇到一些用户，他们讲：引物是你们设计的，也是你们合成的，我做不出，你们就要付责任。
听到这样的抱怨，觉得心寒。
33. PCR扩增不出就引物有问题吗答：基本不是。
当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。
如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。
有些重复片段的扩增， GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1） RT-PCR.请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。
RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。
（2）从基因组中扩增。
一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。
基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH.34. PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗答：不能。
瞧，扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或有污染。
一些用户如是说。
我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。
我们只能说非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。
35. 引物合成的价格合理吗，还有下浮的空间吗答：不合理。
对引物合成的成本，我们做了准确的统计和评估，认为现阶段引物的价格处于一种非理性化状态，价格已基本探底。
引物合成的成本主要由四部分组成：（1）合成原料（2）设备折旧（3）人员费用（4）场地和水电等消耗。
其中合成原料占生产成本占30%，设备折旧占30%，人员费用占20%，场地和水电消耗等20%.我们的合成成本控制是相当到位，原料管理也非常严格，原料进货成本不可能高于同行。
现行的引物合成价格，已让我们感到十分吃力。
我们需要对我们的用户负责，我们需要体现做人的准则，我们需要交税，我们需要收回设备的采购费用，我们需要给我们的用户提供配套服务，这些需要才使我们还在做引物合成。