叶绿素含量测定方法(精)

叶绿素含量测定方法---丙酮法
由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。

藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。

叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。

取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。

采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。

按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。

定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）：
叶绿素a含量用以下公式进行计算：
Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数
叶绿素b含量用以下公式进行计算：
Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数
叶绿素总含量用以下公式进行计算：
Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数
由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。

此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。

叶绿素提取方法
提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300.
一、直接浸提法：
1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。

随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。

2、往藻泥中加二甲基亚砜3.33ml，65℃水浴9h，20h；
3、然后离心，将上清转移到10ml棕色瓶中，
4、添加6.67ml80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清转移到10ml棕色瓶中。

5、定容，待测。

二、研磨法;
1获取藻泥方法同直接浸提法，
2将藻泥转移到研钵中，加入少许碳酸钙和5mlDMSO/80%丙酮(l/2，v/v)，研磨5min，全部转移到15ml具塞离心管中，涮洗3次，
3离心，将上清转移到10ml棕色瓶中，
4定容，待测。

三、涡旋法:
1、获取藻泥方法同直接浸提法
2、往藻泥中加入0.2g石英砂和少许碳酸钙，然后添加1mlDMSO/80%丙酮(l/2，v/v)，
3、在涡旋器上涡旋2min，再添加3mlDMSO/80%丙酮(l/2，v/v)，混匀，
3500r/min离心5min，收集上清于10ml容量瓶，
4、重复步骤3两次
5、用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)定容到10 mL待测。

（1）预处理过程
每种分别取10ml藻液，置于离心管中，在4000r/min条件下离心7min.后弃去上清液，分别加入定量蒸馏水，混匀后再次离心。

此清洗过程重复三次。

后将离心后的藻泥移到25ml容量瓶中，分别加入4ml二甲基亚砜。

后置于恒温箱中60℃6h处理。

最后在8支容量瓶中分别加入16ml100%丙酮，处理一段时间后待测。

（2）测定
设置三组重复，用分光光度计分别测定每个藻种此三个重复在
470nm,645nm,663nm处的吸光度，记录数据。

（3）计算
按下列公式进行计算：
叶绿素a的浓度：Ca=12.21D663-2.81D645
叶绿素b的浓度：Cb=20.13D645-5.03D663
类胡萝卜素的浓度：Cx*c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229
叶绿体色素含量（mg/g干重）=色素的浓度（C）*提取液体积*稀释倍数/样品干重。