微生物检验规范
微生物取样检测检验规范
气
车间
菌落
总数
≤30个/皿
平板暴露法：车间在30m2以上者，于东、西、南、北（距墙1m处）、中五点；小于30m2者，于一条对角线里、中、外三点，高度均在1.5m处采样，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min
取样后的琼脂培养基于37℃温箱培养48h后观察结果，求出5个或3个采样点的平均菌数
2次/月/车间
更衣室
菌落
总数
≤40个/皿
生产用水
菌落
总数
≤100CFU/ml
梯度稀释，倾注接种营养琼脂培养基，36±1℃,48h后计数，报告
对待取样的水龙头进行消毒，并打开水龙头数分钟，用经过灭菌的玻璃采样瓶去水样0.5L后及时送检，采样后按照每125ml水样加入0.1mg硫代硫酸钠除去残留余氯。
1次/月，全年检测完所有水龙头
大肠菌群
不得检出
多管发酵法：1乳糖发酵试验：接种5份10 mL水样双料培养基，每份接种10ml水样，将接种管置36℃士l℃培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白膝培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。2分离培养：将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃土1℃培养箱内培养18h—24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。3证实试验：经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃士1℃培养箱中培养24h士2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。4结果报告：查MPN ( most Probable number，最可能数）检索表，报告每l00ml水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出
微生物检验总则GB 4789.1
2.4 环境与设施 (1) 实验室环境不应影响检验结果的准确性。 (2)实验区域应与办公区域明显分开。 (3)实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要,实验 室布局宜采用单方向工作流程,避免交叉污染。 (4) 实验室内环境的温度、湿度、洁净度及照度、噪声等应符合工 作要求。
(5) 食品样品检验应在洁净区域进行,洁净区域应有明显标示。 (6) 病原微生物分离鉴定工作应在二级或以上生物安全实验室进行
主要作用于DNA,使DNA形成胸腺嘧啶二聚体，使微 生物DNA失去转化能力而死亡。
2.3.2湿热灭菌
湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流 通蒸汽进行灭菌的方法。压力蒸汽湿热灭菌法 是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸 汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的 穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死 亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、 胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。
2.2微生物基本操作
30%
梯度稀释
平板倾注
45%
35%
平板划线
斜面穿刺 平板涂布
革兰氏染色
55%
50%
30%
60%
涂片及固定
数量对比
2.2.1梯度稀释
（1）用酒精棉消毒操作台面。 （2）点燃酒精灯，左手于酒精 灯火焰附近打开移液器吸头盒， 右手持移液器取枪头。 （3）用酒精灯火焰灼烧试管口 部，将枪头伸入试管，吸取足量 液体，再次灼烧试管口部，塞上 塞子。 （4）将待接种试管塞打开，用 酒精灯火焰灼烧试管口部，将液 体打入待接种试管，再次灼烧试 管口部，塞上塞子。
2.2.4斜面穿刺
操作时用笔直的接种针，从 长有目标菌的培养基上挑取少量 菌苔，将接种针平稳刺入培养基 ，勿触到管底，也不可碰到试管 内壁，然后沿原穿刺途径慢慢抽 出接种针，最后在斜面上进行“ 之”字划线。
微生物限度检查法标准操作规程完整
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查 供试品微生物计数中 所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性 试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法 适用性试验。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102])
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于。滤膜直径一般为50mm。滤器及滤膜使用 前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供 试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应 注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要 用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000m1；以免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”和“接种和 稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品 中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用 适量的冲洗液冲洗滤膜。测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨 琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖 琼脂培养基平板上，按规定条件培养、技术。每株试验菌每种培养基至少制备1张滤膜。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。
微生物限度检查操作规程
更改历史微生物限度检查操作规程1.0 目的建立微生物限度检查标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确2.0 范围适用于本公司采用微生物限度检查法测定的供试品。
3.0 职责质量部负责按本规程的要求执行微生物限度检查操作。
4.0 工作程序4.1 洁净区间的确认微生物计数检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全部过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品（即待检样品、产品）中微生物的检出。
4.2 培养基4.2.1 应使用按中国药典处方及规定的方法制备的培养基。
4.2.2 所用培养基可按中国药典规定的处方及制备方法自行配制，也可使用按中国药典规定的处方生产的脱水培养基进行配制；或购买商品化的预制培养基。
4.2.3 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25℃、避光的环境下保存。
4.2.4 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
4.2.5 供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
4.2.6 供试品的微生物计数方法、控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数或控制菌检查。
4.3 菌种及菌液制备检查所用的菌种及菌液制备见附件 1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
稀释剂、冲洗液及其制备的要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查。
4.4 培养基的适用性检查供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
微生物限度检查所用的培养基每批均应进行适用性检查，检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。
具体要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
4.5 方法适用性试验供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
检验科微生物监测操作规程
1．目的规范检验科的微生物检测。
2．适用范围适用于检验科的微生物空气监测。
3．操作步骤3.1 检验科实验室空气培养监测3.1.1采样及检查原则采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h。
若样品保存0—4℃条件时，送检时间不得超过24h。
3.1.2. 采样时间检验科各室空气培养在每月下旬，选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。
3.1.3 采样高度与地面垂直高度80—150cm。
3.1.4 布点方法室内面积≤30m3，设一条对角线上取3点，既中心一点、两端各距墙1m处各取一点：室内面积＞30m3，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m。
3.1.5 采样方法用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min后送检培养。
盖上盖子，并填写好检验单，送细菌室培养。
3.2 48h后，观察结果。
各个实验室空气培养要求在：≤4CFU／m3。
监测时间:根据不同的特殊重点部门,每1～3个月监测一次.当发生医院感染流行,高度怀疑或确定与空气,物体表面,医务人员手的污染有关时,可随时进行监测.4．处理根据培养结果，对检验科的消毒灭菌效果进行总结，采取积极的应对措施，使检验科的微生物监测符合要求。
1．目的规范检验科的微生物检测。
2．适用范围适用于检验科的微生物物表监测。
3．操作步骤3.1 检验科实验室物表培养监测3.1.1 物体表面采样方法3.1采样时间检验科各室空气培养在每月下旬，选择消毒处理后4h内进行采样。
3.3采样方法①采样面积被采表面＜100cm2，取全部表面：被采表面≥100cm2，取100cm2。
用5×5cm2的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭纸1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭纸，连续采样1—4个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭纸放入装10ml采样液的试管中送检。
门把手等小型物体则采用棉拭纸直接涂抹物体的方法采样。
微生物检验规程
第二节玻璃器皿的清洗操作一、新玻璃器皿的清洗新购置的玻璃器皿含有游离碱，应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，再用水充分冲洗干净。
二、载玻片及盖玻片的清洗1、新载玻片和盖玻片先在2%的盐酸溶液浸泡1小时，然后用自来水冲洗2~3次，最后用蒸馏水换洗2~3次。
2、用过的载玻片，应用纸擦去油垢，然后散入煮沸的1%洗衣粉液中持续煮沸30分钟（注意煮沸掖一定要浸泡玻片，否则会使玻片钙化变质），待冷却后用自来水冲洗至中性。
3、将用过的盖玻片放入1%洗衣粉液中，煮沸1分钟，待沸点泡平下后，再煮沸1分钟，如此2~3次，待冷却后用自来水冲洗干净。
三、使用后平皿的清洗1、有细菌大量生长的平皿，首先需将培养皿进行45min/121℃灭菌，然后浸泡入1%洗衣粉液中约2小时，再用自来水冲洗。
若有油脂黏附，可用刷子粘洗衣粉来擦洗，再用自来水冲洗干净。
必要是用50ppm二氧化氯消毒液浸泡30min 以上。
2、无细菌生长的平皿，浸泡入1%洗衣粉液中约2小时，再用自来水冲洗。
3、二氧化氯消毒液的配制：取消毒剂原液10ml和活化剂1ml，加入100ml自来水，静置5~10分钟，加入至1桶即可。
四、使用后试管的清洗1、有细菌生长的试管培养物都必须先进行高压灭菌处理（45min/121℃），将培养物倒到废物桶后，将试管及发酵管口朝上浸泡在1%洗衣粉液中，要求浸没试管，浸泡2小时后用流动水反复冲洗3~5次，然后将试管口朝下斜靠在烘箱内壁，85℃以上干燥。
2、无细菌生长的试管直接浸泡在1%洗衣粉液中，清洗方法同上。
3、发酵管的清洗：发酵管因口径小，管内水不易排出，需反复用力甩3~5次，每次甩后用流动水冲洗。
若仍难于洗净时，则可放入自来水中煮沸10~15分钟，冷却后再甩水。
发酵管的烘干温度为100~115℃（100℃以下难于烘干）。
五、移液管的清洗1、使用后的移液管若无油脂等难清洗物粘附，可直接用流动自来水反复浸泡冲洗3~5次，然后细口朝下斜靠在烘箱内100~115℃烘干。
微生物检验操作规范
微生物检验操作规范微生物检验是临床上常见的一种检验方法，在检验过程中，如果操作人员操作不规范，很容易导致微生物感染。
一、样品打开和处理接收和打开样本的人员应了解样本对健康的潜在危害，并接受如何使用标准保护方法的培训，特别是在处理破损或泄漏的容器时。
标本的内容器应在生物安全柜中打开，并准备消毒剂。
打开试样进行加工时：1、标本管应在生物安全柜内打开。
2、必须戴手套，并建议保护眼睛和粘膜（护目镜或口罩）。
3、打开试样管时，用纸或纱布抓住塞子，防止飞溅。
二、避免注入传染性物质1、通过认真的实践和操作，避免了因损坏玻璃器皿刺伤而引起的接种感染。
尽量用塑料制品代替玻璃制品。
2、尖锐的工具损坏（如通过皮下注射针、巴斯德玻璃吸管和碎玻璃）可能导致意外注入感染性物质。
3、以下两点可以减少针刺损伤：（1）减少注射器和针头的使用（可以使用一些简单的工具打开瓶塞，然后用吸管代替注射器和针头取样）；（2）当必须使用注射器和针头时，采用配套的锐器装置以确保安全安装。
4、不要再将护套放在用过的注射器针头上。
一次性物品应丢弃在容器中，容器盖应能防止锐器渗透。
三、血清分离1、这项工作只能由受过严格训练的人员进行。
2、术中戴手套及眼、粘膜防护用品。
3、标准的实验操作技术可以避免或减少飞溅物和气溶胶的产生。
血液和血清应小心吸取，不得倾倒。
禁止用嘴吸液体。
4、吸管使用后应完全浸入消毒剂中。
移液管应在消毒剂中浸泡一段时间，然后丢弃或消毒并清洗以供再次使用。
5、带血凝块的废弃样品管加盖后，应放置在适当的防漏容器中进行高压灭菌和/或焚烧。
6、应准备一种合适的消毒剂，以清洗溅出的样本。
四、血液和其他体液、组织和排泄物的标准保护方法设计标准保护方法（包括“常规预防措施”），以降低已知或未知感染源的微生物传播风险。
五、玻璃器皿和锐器1、尽量用塑料制品代替玻璃制品。
只能使用实验室级（硼硅酸盐）玻璃，任何破碎或破裂的玻璃产品都应丢弃。
2、皮下注射针不能用作吸管。
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程《微生物限度检查标准操作规程》一、目的微生物限度检查是药品、食品、化妆品等产品质量的重要指标之一，其目的是为了保障产品的安全性和稳定性。
本标准操作规程旨在规范微生物限度检查的操作流程，确保检查结果的准确性和可靠性。
二、范围本标准操作规程适用于药品、食品、化妆品等产品的微生物限度检查，包括大肠菌群、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等微生物指标的检查。
三、检查设备和试剂1. 培养基：根据不同的微生物指标选择适当的培养基，如大肠培养基、Mannitol盐琼脂、Sabouraud葡萄糖琼脂等。
2. 培养皿：使用符合规定的试验培养皿。
3. 培养箱：保证培养条件的恒温培养箱。
4. 其他常用实验用具：包括无菌采样容器、吸管、移液器、无菌培养皿等。
四、操作流程1. 样品采集：从产品中采集适量样品，保持无菌状态。
2. 制备稀释液：根据样品的特性，选择适当的稀释液将样品进行适当稀释。
3. 接种培养：将稀释后的样品接种在适当的培养基上，并在符合条件的培养箱中进行培养。
4. 观察和统计：观察培养皿中微生物的生长情况，统计出微生物的数量。
5. 结果判定：根据标准规定的微生物限度标准，判断检测结果是否符合规定。
五、质量控制1. 实验员必须进行严格的无菌操作训练，并使用正确的个人防护用具。
2. 培养基的质量必须符合规定，避免培养基带有细菌污染。
3. 检查设备必须经过定期的检查和校准，保持正常的工作状态。
4. 标本的采集、处理、保存和运送必须符合规定，避免外界的污染和干扰。
六、结果报告根据检测结果和规定的限度标准，出具检测报告，标明产品的微生物限度是否符合规定，以及具体的检测结果数据。
七、总结微生物限度检查是产品质量检验的重要环节，严格按照标准操作规程进行操作，可以保证检测结果的准确性和可靠性。
实验员在操作过程中也需严格遵守规程，做好个人防护措施，确保实验室的安全和卫生。
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微生物检验规范1.目的明确微生物检验方法和监控标准，规范微生物检验的各项操作，通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试，从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。
2.适用范围公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。
3.职责3.1 品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。
3.2品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登记和微生物检测工作。
3.3成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作，品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作。
3.4品保微生物检验员负责出具检测报告并作出符合性判定。
3.5品保科长负责微生物检测报告的审核。
4.作业程序4.1实验器材4.1.1 实验器材、培养基和试剂1．超净工作台2．恒温培养箱36±1℃3．低温培养箱25-28℃ 4．恒温水浴锅46±1℃5．电子/托盘天平（精确到0. 1g）6．高压蒸汽杀菌锅7．烘箱8．酒精灯9．记号笔10．打火机11．镊子12．药匙13. 生物滤膜14．培养皿9cm/6cm15. 锥形瓶300ml/500ml+硅橡胶塞16．试管17．小发酵管18．试管架19．接种环20．显微镜21．塑料篮子22．移液管1ml、5ml、10ml23. 膜过滤设备24. 医用不锈钢剪刀4.1.2培养基和试剂1．总菌数培养基平板计数琼脂培养基2．大肠菌群培养基结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）3. 霉菌、酵母菌培养基虎红培养基4．氯化钠6．乙醇7．二氧化氯粉剂8. 过氧乙酸4.2 微生物检验的前准备4.2.1检验所需器具的灭菌4.2.1.1培养皿及移液管的干热灭菌洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于120℃干热灭菌120分钟后，调至160-180℃干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至60℃以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。
4.2.1.2锥形瓶及移液管的湿热灭菌洁净的锥形瓶，塞上硅橡胶塞并用牛皮纸包扎好瓶口，洁净的移液管，用牛皮纸包扎完善后，置于蒸汽灭菌锅中，于121℃湿热灭菌20分钟即可。
4.2.1.3镊子、接种环等的火焰灭菌接种环、镊子要在酒精灯上须灼烧过方可使用；稀释操作时试管口应在火焰上方；培养基容器口边在火焰上方。
4.2.1.4化学灭菌（75%酒精、100×10-6ClO2）无菌超净台，手部及不能加热灭菌的PE或塑胶制品，桌子等需用化学灭菌法；操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用100×10-6 ClO2擦洗灭菌。
4.2.2培养基及其缓冲稀释液的配制和湿热灭菌4.2.2.1 0.9%生理盐水的配制称取2.25g氯化钠，溶于250ml蒸馏水中，经湿热灭菌即可。
4.2.2.2 75%酒精的配制取375ml无水酒精，则需加水375/0.75-375=125ml4.2.2.3培养基的配制和灭菌条件灭菌完全后的培养基置于46±1℃的水浴锅中,待培养基的温度降至46±1℃方可用.4.2.2.4 湿热灭菌的步骤：（1）检查蒸压釜中有否足够的水。
（2）检查所有载有液体瓶子的螺旋盖（或塞）是否有松动。
（3）检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。
（4）小心地关好杀菌釜的盖/门。
除非每个锁都已彻底锁紧，否则不得加压。
（5）检查排气道或排气阀是否打开。
（6）加热，使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。
蒸汽要猛烈排放2-3min，以保证蒸压釜内冷空气全部排出。
关闭通风阀或排气阀。
（7）继续加热，至达到预定压力及温度。
设备和培养基将在121℃下维持20min，以进行灭菌。
所需压力要连续维持一定时间。
（8）所需加热时间一过，停止加热。
在排气阀不打开的情况下让压力自动下降到零。
否则不要打开蒸压釜。
当压力为零时，小心打开排气阀，待蒸气排尽后，打开蒸压釜盖，让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽，并将釜内原载有的物品充分冷却。
（9）取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子，将这些瓶子存放在无菌室的传递箱中待之冷却备用。
灭菌完成后的培养基，温度降至46±1℃方可使用。
所有灭菌完成后的物品，在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态。
4.2.3无菌室及超净台的灭菌4.2.3.1每天实验前、后把无菌室地面及超净台打扫干净，每天用100×10-6 ClO2消毒桌面、地面。
每月用2%过氧乙酸熏蒸。
4.2.3.2实验结束后打开紫外灯对无菌室空间和表面进行杀菌1小时。
4.2.3.3实验前，提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。
关掉紫外灯后，打开无菌室和超净台通风装置，30分钟后，即可进行实验操作。
4.3.样品的抽样和判定标准4.3.1实验前应登记样品，给样品编号，记录检验时间、品项、规格、生产日期、批号、检测项目等，并根据样品数来配制培养基。
4.3.2样品的抽样和判定标准天然水的产品名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准备注：按抽样频率，检验方法一半采用GB-4789，一半采用滤膜法。
4.3.3生产线微检监控点的样品的抽样和判定标准各监控点名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准4.4微生物检测方法4.4.1滤膜法: 适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。
4.4.1.1 仪器：冰箱：0～4℃；恒温培养箱：36±1℃/25-28℃；恒温水浴锅：46±1℃；电子天平：精确至0.1g；灭菌平皿:直径60mm或90mm；膜过滤设备；滤杯；0.45μm滤膜；超净工作台；真空泵；高压灭菌锅；灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品。
4.4.1.2试剂与培养基平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基，0.9%生理盐水，121℃灭菌20min；结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2min；75%乙醇；100ppm二氧化氯。
4.4.1.3操作步骤:（1）将样品摇匀，取100ml倒入膜过滤装置中，打开抽滤泵，开始抽滤，抽干滤液后关上抽滤泵。
（2）将镊子在火焰上灭菌，膜用灭菌过的镊子取下，在火焰旁正面贴于预先制备的培养基平皿中，平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数，虎红琼脂培养基用于培养霉菌和酵母菌，VRBA培养基用于培养大肠菌群，膜下避免出现气泡。
（3）培养a.菌落总数：倒置于36±1℃的恒温箱中，培养48h±2h。
菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。
b.霉菌和酵母菌：倒置于25-28℃恒温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。
c.大肠菌群①倒置于36±1℃的恒温箱中，培养18h-24h。
取出平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
②从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h~48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
③大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以①中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每100ml样品中大肠菌群数。
例：在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10/100ml=60cfu/100ml。
4.4.2国标法：适用于不能用滤膜法检测的各种微检样品以及规定用国标法检测的样品。
4.4.2.1菌落总数4.4.2.1.1设备与材料：冰箱：0～4℃；恒温培养箱：36±1℃；恒温水浴锅：46±1℃；电子天平：精确至0.1g；灭菌吸管；灭菌平皿：直径90mm或60mm；超净工作台；高压灭菌锅及其它物品。
4.4.2.1.2培养基与试剂：平板计数琼脂培养基，0.9%生理盐水，121℃灭菌20min；75%乙醇；100×10-6 ClO2溶液。
4.4.2.1.3操作步骤：（1）样品稀释及培养a.以无菌操作取样品。
b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1：10的样品匀液。
c.用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。
d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。
在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。
及时将6-7ml或15-20ml 冷却至46℃的培养基倾注入平皿。
采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。
f.待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃±1℃恒温箱内培养48±2h。
(2)菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器。
记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。
a.选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
b.其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
c.当平板上出现菌藻间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
(3) 菌落总数的计算方法a.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。
b.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一个适宜稀释度平板上的菌落数；n2——第二个适宜稀释度平板上的菌落数；d——稀释因子（第一稀释度）。
c.若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
d.若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。