微生物实验技术一
微生物学实验一 微生物制片及形态观察
实验一微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。
显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
1. 结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。
光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。
图1－1 光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。
焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。
油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。
目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。
聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。
聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。
显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。
一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。
有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。
2. 原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
3. 使用方法1）低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。
实验一显微镜油镜的使用及微生物基本实验技术
实验一显微镜油镜的使用及微生物基本实验技术实验一显微镜油镜的使用及微生物基本实验技术一、实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术。
2. 了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
3. 掌握微生物实验的操作技能。
二、实验内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．用油镜观察细菌和酵母菌染色装片。
3. 学习微生物实验的操作技能。
三、实验材料和用具细菌三型、酵母菌染色装片；显微镜、香柏油、擦镜液、擦镜纸；试管、培养皿、移液管、纱布、棉花等。
四、操作步骤（一）显微镜油浸的使用1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm，坐正。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm 左右。
转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。
观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
3. 低倍镜观察染色装片首先下降镜台，将酵母菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至低倍镜正下方，镜台升至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使镜台下降至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
4. 高倍镜观察染色装片眼睛离开目镜从侧面观察，旋转物镜转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。
再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部位移至视野中心。
不要移动装片位置，准备用油镜观察。
5. 油镜观察染色装片提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油；从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头；将光线调亮，从目镜观察，用粗调节器将镜台徐徐下降(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。
微生物生物化学实验技术
微生物生物化学实验技术微生物生物化学实验技术是一门涉及微生物和生物化学的实验技术学科，其研究内容包括微生物的生长特性、代谢途径、原生态功能等方面。
在实验室中，通过一系列实验手段和技术手段，可以研究微生物的生物化学过程，揭示微生物在环境中的作用和影响。
一、菌种的保存和鉴定在微生物生物化学实验技术中，首先需要进行菌种的保存和鉴定工作。
菌种的保存是为了长期保存某种微生物，以备后续实验使用。
常见的保存方式包括在琼脂培养基上制备菌斑、制备冻干粉末或低温冷冻保存等。
而菌种鉴定则是为了确保所使用的微生物种属准确，常见的鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性检测、分子生物学技术等。
二、微生物生长曲线的绘制和分析微生物生长曲线是研究微生物生长和繁殖规律的重要手段。
利用实验技术，可以通过不同培养条件下不同时间点的菌液浓度进行测定，从而得到微生物生长曲线。
通过绘制生长曲线并进行数据分析，可以了解微生物在不同生长阶段的生长速率、最大生长速率、最大生长速率等参数。
三、微生物代谢产物的检测和分析微生物代谢产物是微生物在代谢过程中产生的各种物质，包括有机酸、氨基酸、酶等。
通过实验技术，可以对微生物代谢产物进行检测和分析，了解微生物的代谢途径和代谢产物的种类及含量。
常见的检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等。
四、微生物酶活性的测定和应用微生物酶是微生物体内产生的一种特殊蛋白质，具有催化作用。
通过实验技术，可以对微生物酶的活性进行测定，了解酶的催化特性和反应底物的种类。
此外，微生物酶在生物化学工程、食品工业、医药等领域有着广泛的应用，通过研究微生物酶的活性和性质，可以进一步开发和利用其潜在的应用价值。
五、微生物工程技术的发展趋势随着现代科学技术的不断发展，微生物工程技术也在不断更新和完善。
新兴的技术包括代谢工程、系统生物学、合成生物学等，将为微生物生物化学实验技术的发展带来新的契机和挑战。
同时，微生物生物化学实验技术在环境保护、资源利用、新药开发等方面具有广阔的应用前景，将为人类社会的可持续发展做出重要贡献。
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
微生物实验
①标 本
③ 孔径 光栏
⑤ 光轴中心调节 螺钉
③ 视场 光栏
N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
操作步骤如下: (1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水
平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可 变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的 中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。
实验一培养基的配置、灭菌与无菌操 作技术
1、明确培养基的配制原则，掌握配制培养基的一般方法 和步骤； 2、掌握玻璃器皿的洗涤和包扎方法，了解玻璃器皿的灭 菌方法和原理； 3、了解几种常用灭菌方法的基本原理及应用范围； 4、掌握高压蒸汽灭菌技术，。
微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭 菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包 装方法均有一定的要求。清洁的玻璃器皿是实验 得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防 止污染杂菌。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若 用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎。
为什么要将培养基倒置培养？
显微镜概述 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因
此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工 具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握 不同显微镜的使用方法是很有必要的。
显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学 显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微 镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显 微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。
一、目的要求 1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3.学习微生物涂片、染色的操作技术；
4.掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；
5.掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。
微生物常用实验3篇
微生物常用实验第一篇：细菌涂片染色实验细菌涂片染色实验是微生物学中最基本的实验之一。
通过染色方法，使细菌变得可见，便于观察形态、结构、数量等特征，有利于研究其生长、代谢、致病性等方面。
下面，我们来介绍细菌涂片染色实验的具体步骤：一、制备细菌涂片1.取出培养基上生长良好的细菌菌落，用不锈钢嵌片环沿中心点轻压一下。
2.将嵌片环中的菌落涂匀于无菌载玻片上，制备成直径约1厘米的薄片。
3.待载玻片上的细菌涂片晾干，并用火焰消毒。
二、涂片染色1.用火焰将铺有细菌涂片的玻片烤干。
2.将烤干的玻片浸入甲醇中，固定一分钟，再用水漱洗。
3.将玻片浸入碘酒中，固定一分钟，再用水漱洗。
4.将玻片浸入乙醇中，使背景颜色褪去，再用水漱洗。
5.将玻片浸入洋红染色液中，染色时间不超过1分钟。
6.用水冲洗干净，晾干后可以在显微镜下观察。
通过细菌涂片染色实验，我们可以直观地观察到细菌的形态、大小、聚集情况、颜色等，有助于鉴定细菌种类，并进一步深入研究其生物学特性。
第二篇：厌氧培养实验厌氧菌是一类生长需要在完全无氧条件下进行的微生物。
在许多疾病的发病机制中，厌氧菌都发挥着重要作用，因此，研究厌氧菌对于认识疾病的发病机制具有极其重要的意义。
下面，我们来介绍厌氧培养实验的具体步骤：一、制备厌氧培养基制备厌氧培养基是进行厌氧菌培养的关键。
具体操作步骤如下：1.准备培养基，并在其中加入培养菌株所需的配方和其他适宜的添加剂。
2.将培养基分装到无菌针筒或暗口瓶中。
3.在体积的一半至三分之二处加入去氧剂（一般为Thioglycolate或Dithiothreitol）。
二、厌氧细菌接种与培养1.准备厌氧细菌培养物的接种种子。
一般情况下，把生长适应在厌氧条件下的细菌进行分生处理来获得设计数量的细胞，并将其重新悬浮在与培养基相同的缓冲液中。
2.在无氧条件下接种厌氧菌，避免暴露于空气中。
可以通过使用瓶盖和橡胶塞的局部替代或全封闭气密容器的方法来实现无氧条件。
微生物实验—三平板分离技术1
实验三微生物分离纯化技术一、目的要求掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作二、实验材料1、菌种2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基3、试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿三、实验原理平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。
浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。
最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。
涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。
四、实验过程（1）稀释平板法A 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。
先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
B 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边；C 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。
微生物学实验技术
微生物学实验技术
微生物学实验技术是研究和发掘微生物的重要方法，也是一门多种实验技术和方法的
综合。
它既可以应用于生物体内，对微生物调查，可以使用培养基或特定介质进行鉴定，
也可以用来通过遗传工程分离、改造微生物，了解不同微生物的全部 trait 特性。
一、培养微生物
培养微生物是一种最常用的微生物实验技术，需要使用特定的培养基，通过控制温度、湿度等变量的变化来培养不同的微生物。
通过检测培养基中的微生物数量及某些代表性特征，可确定微生物的分类特征，来鉴定微生物的种类和形式。
二、基因组测序
基因组测序是一种实验技术，是分析一个微生物种类全部 genetic 的方法。
主要利
用高通量DNA测序技术，对样品中贮藏的 DNA 进行范围检测，得到 DNA 的测定序列，从
而确定微生物的遗传结构、物种种类，以及特定物种生态和功能特征。
三、共价法抗菌药敏试验
共价法抗菌药敏试验是研究微生物对一类药物或多类药物的抗性程度的重要方法之一。
通过检测药物剂量的不同，在药物浓度相同的情况下微生物在某种时间内生长情况不同，
来确定微生物对某种药物或多类药物的抗性情况。
四、特异性提取
特异性提取是一种以特定方法从微生物中提取出特定“ biomolecule ”，比如 DNA、蛋白质等，分离和纯化微生物某功能元件或特征分子的实验技术。
这种技术既可以提取大
量的基因片段，也可提取微量的特异性物质。
五、遗传修饰
遗传修饰是一种利用遗传工程改造或添加微生物特定遗传物质来改变微生物的特性的
实验技术，常用来进行分子育种和改良育种，以提高产品的质量和性能。
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• 基本构造 – 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 – 成像系统：物镜、中间镜、投影镜 – 真空系统：用两级真空泵抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的 高真空。 – 记录系统：用荧光屏显示或感光胶片作记录。
• 用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差， 再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜，然后用 消化液把样品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微 粒移到载网上进行电镜观察。
• 冷冻蚀刻技术主要用来观察断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结 构，样品不需包埋、固定，能更好地保持样品的真实结构。
• 2θ最大值 = 140℃，空气中n = 1，最短的可见光波长λ = 450nm，分辨率D = 292nm，约0.3um
• 油镜：n = 1.52，D = 0.2um
• 普通光镜的最大分辨率D = 0.2um
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2. 相差显微镜技术 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• 荧光： – 自发荧光：通过激发光使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A – 诱发荧光：通过诱导剂作用而发出的荧光，如甲醛蒸汽处理诱发细 胞和组织中生物单胺类产生荧光 – 荧光染料染色荧光：丫啶橙对细胞DNA、RNA同时染色后，DNA 呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。
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电磁透镜
1.33×10-5~ 利用样品对电子的散 1.33×10-3Pa 射和透射形成明暗反
差
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超薄切片技术
• 固定-- 脱水-- 包埋-- 切片--染色 – 固定：要求保持样品的形态结构不发生改变，常用固定剂为戊二 醛和锇酸等，通常在低温下固定。 – 包埋：使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好的支 撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并 能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包 埋剂为环氧树脂。包埋剂多与水不相溶，所以包埋前要经过一系 列脱水处理。 – 切片：厚度通常为40~50nm，常用玻璃刀。 – 染色：用重金属盐进行染色以形成明暗反差。样品中不同成分对 染料有不同亲和性（脂肪：锇酸；蛋白质：铅盐；核酸：醋酸铀）
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电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别
光学显微镜
分辨本领 光源
200nm
可见光
(λ:400-700nm)
100nm 紫外光
(λ约200nm)
透镜 玻璃透镜
玻璃透镜
真空 不要求
不要求
成像系统 利用样品对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化
电子显微镜
约0.1nm
电子束 (λ:0.01~0.9nm)
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一、显微镜技术
• 光学显微镜技术 – 普通光学显微镜技术 – 相差显微镜技术 – 荧光显微镜技术
• 电子显微镜技术
1.普通光学显微镜技术 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（light microscopy）
• 结构 – 光学放大系统：物镜（油镜、高倍镜和低倍镜）和 目镜（10×、16×） – 照明系统：光源、反光镜和聚光器 – 机械和支架系统
（phase-contrast microscopy）
• 相差显微镜与普通显微镜的区别：
– 在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区 域，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的 光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这 两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象， 表现出肉眼可见的明暗区别。
(fluorescence microscopy)
• 仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统 • 原理：荧光物质，激发光，发射光
– 利用一个高发光效率的点光源（高压汞灯），以最小表面释放出最 大数量的紫外光（365nm）和蓝紫光（420nm），经过滤色系统， 作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后， 再通过物镜和目镜（石英玻璃制成）的放大进行观察，这种荧光在 显微镜下很容易辨认，敏感性高，能对细胞的特定物质进行定性、 定位和定量观察。
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分辨率
• 分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。 D = 0.61λ/ (n·sinθ) D：分辨率 λ：波长 n：物镜与物体间介质折射率 2θ：物镜镜口角 N.A：即n·sinθ，数值孔径
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冷冻蚀刻技术
• 方法 – 冷冻 —快速低温冷冻法
• 将样品在液氮或液氦中迅速冷冻
– 断裂—低温下断裂 – 蚀刻：在真空中冰升华 – 复型
• 相差显微镜将光程差或相位差转换为振幅差，即明暗差别。 相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞及细胞内的某 些细微结构。
– 光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同，密度大则光的滞留 时间长，密度小则滞留时间短。
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3. 荧光显微镜技术 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
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4. 电子显微镜技术 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 （electron microscopy）
• 原理：使用波长比可见光短得多的电子束作为光源（波长一般小于 0.1nm），用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图象需用荧光屏 来显示或感光胶片作记录。