食品微生物学实验技术
食品微生物检验技术存在的问题及对策探讨
食品微生物检验技术存在的问题及对策探讨随着食品安全问题日益引起人们的关注，食品微生物检验技术也越来越受到重视。
食品微生物检验技术是评价食品安全和卫生质量的重要手段之一，可以快速、准确地检测食品中的微生物污染情况，为食品生产和加工提供科学依据。
食品微生物检验技术在应用过程中也存在着一些问题，本文将对其存在的问题进行探讨，并提出相应的对策。
1. 技术标准不统一目前，食品微生物检验技术的标准并不统一，不同地区和部门有着不同的标准和要求。
这就导致了在食品微生物检验过程中，不同实验室之间的检测结果存在较大的差异，给食品安全监管带来了一定的困难。
2. 检测方法不完善目前，食品微生物检验技术所采用的方法多为传统的培养技术，这种方法需要较长时间来得到结果，且对样品的预处理和培养条件有一定的要求，容易受到外界环境的影响，导致检测结果的准确性不高。
3. 检测成本较高传统的食品微生物检验方法需要消耗较多的人力、物力和时间，成本较高，不利于大规模的应用和推广。
尤其是在一些农村地区和小型食品生产企业，往往由于条件限制无法进行微生物检验，给消费者的食品安全带来了较大隐患。
4. 缺乏检验人员食品微生物检验技术需要专业的检验人员进行操作，然而当前我国的检验人员短缺，且专业水平参差不齐，这就为食品微生物检验的准确性和可靠性埋下了隐患。
5. 测定方法有待更新目前，食品微生物检验技术的测定方法还停留在传统的培养和计数阶段，对于一些新型的微生物污染物质还没有较为完善的检测手段，这就给食品安全监管带来了一定的挑战。
二、对策探讨针对食品微生物检验技术的标准不统一这一问题，有关部门可以借鉴国际上先进的标准和经验，进行整合和完善，建立起严谨的技术标准，以确保检验结果的准确性和可靠性。
在食品微生物检验技术中，应该大力推广新型的检测方法，如PCR法、基因芯片技术等，这些方法不仅能够提高检测速度和准确性，还可以减少人力和物力的使用，降低成本。
3. 加强人才培养有关部门应该加大对食品微生物检验人员的培训力度，提高他们的专业水平和技术能力，确保他们具备提供准确、可靠的检测结果的能力。
微生物学实验技术(研究生)
食品微生物实验技术讲义（硕士研究生用）食品科学与工程学院微生物学实验技术的体系具有独特性：需要独特的实验室装备和独立的训练技术包括：显微镜术和制片染色技术、无菌操作技术、消毒灭菌技术、纯种分离培养技术、合成培养基技术、选择性和鉴别性培养基技术、深层液体培养技术、厌氧培养技术、菌种保藏、复壮技术、菌种选育技术等。
第一章微生物的纯培养和显微技术计划学时：2重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。
细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。
大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。
在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。
实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。
第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。
因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。
微生物学实验技术的应用
微生物学实验技术的应用微生物学实验技术是研究微生物的重要手段，广泛应用于医学、环境科学、食品工业、农业等领域。
本文将围绕微生物学实验技术的应用展开阐述。
一、微生物学实验技术在医学中的应用微生物学实验技术在医学中起着重要的作用。
例如，在病原微生物的检测和鉴定中，常用的实验技术包括细菌培养、PCR法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
这些技术可用于快速准确地检测和鉴定病原微生物，为临床诊断和治疗提供依据。
此外，微生物学实验技术还广泛应用于抗菌药物的研发和耐药性检测等方面，为临床治疗提供了强有力的支持。
二、微生物学实验技术在环境科学中的应用环境中的微生物是一种重要的生物指示器，可以反映环境的污染程度和生态系统的健康状况。
微生物学实验技术可以用来监测环境中的微生物多样性和群落结构，分析微生物在环境中的分布和变化规律。
例如，通过分析水体、土壤和大气中的微生物群落，可以评估环境的污染程度和生态系统的稳定性。
此外，微生物学实验技术还可以用来研究微生物对环境因子的响应和适应机制，为环境保护和生态修复提供科学依据。
三、微生物学实验技术在食品工业中的应用微生物学实验技术在食品工业中起着重要的作用。
例如，在食品的质量检测和卫生监测中，常用的实验技术包括微生物培养、PCR法、酶活性检测等。
这些技术可用于检测食品中的致病微生物和食品安全指标，确保食品的质量和安全。
此外，微生物学实验技术还可以用于食品发酵工艺的研究和优化，提高食品的品质和营养价值。
四、微生物学实验技术在农业中的应用微生物学实验技术在农业中具有广泛的应用前景。
例如，在农作物的病害防治中，可以利用微生物学实验技术筛选和应用有益微生物，如生物农药和生物肥料，实现绿色农业的可持续发展。
此外，微生物学实验技术还可以用于土壤微生物的监测和调控，提高土壤的肥力和抗逆性。
另外，微生物学实验技术还可以用于农产品的质量检测和加工改良，提高农产品的商品价值和市场竞争力。
微生物学实验技术在医学、环境科学、食品工业和农业等领域具有广泛的应用。
食品微生物检验技术GB4789.2-2010 菌落总数测定
(4) 按 (3) 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀 液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管 或吸头。 (5) 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个 适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）， 在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液 于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时， 分别吸 取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内 作空白对照。 (6) 及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计 数琼脂培养基（可放置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴 箱中 保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2. 培养 (1) 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h。水产品 30 ℃±1 ℃培养 72 h±3 h。 (2) 如果样品中可能含有在琼脂培养基表 面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂 表面覆盖一薄层 琼脂培养基（约 4 mL）， 凝固后翻转平板，按 36 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h（水产品 30 ℃±1 ℃培养 72 h±3 h）条件进行培养。
GB 4789.2-2010 食品安全国家标 准 食品微生物学检验 菌落总数测定
一、设备和材料 二、培养基和试剂 三、检验程序 四、操作步骤 五、结果与报告
一、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和 材料如下： (1) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 (2) 冰箱：2 ℃～5 ℃。 (3) 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 (4) 天平：感量为 0.1 g。 (5) 均质器。 (6) 振荡器。 (7) 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 (8) 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL。 (9) 无菌培养皿：直径 90 mm。 (10) pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 (11) 放大镜或/和菌落计数器。
食品微生物检验技术PPT
分子生物学方法
基于核酸探针、PCR等分 子生物学技术，能够快速、 准确地检测出食品中的微 生物。
02
食品微生物检验技术方法
培养法
总结词
培养法是食品微生物检验中最传统的方法，通过培养基培养微生物，观察其生 长情况以确定微生物种类和数量。
详细描述
培养法具有简单易行、直观可靠的优点，适用于大多数微生物的分离、鉴定和 计数。但该方法耗时较长，且需要经验丰富的专业人员进行操作。
要点二
实时荧光定量PCR技术
利用实时荧光定量PCR技术，可实现快速、准确地检测食 品中特定微生物的数量，为食品安全控制提供科学依据。
THANKS
感谢观看
验结果的准确性。
国内食品微生物检验规范
食品安全国家标准食品微生物学检验总则
规定了我国食品微生物学检验的基本要求、抽样、检验方法及结果的判定等。
食品安全国家标准食品微生物学检验人员要求
规定了从事我国食品微生物学检验人员的资格要求、培训和考核等。
食品安全国家标准食品微生物学检验实验室设施和环境条件
规定了我国食品微生物学检验实验室的设施和环境条件，以确保检验结果的准确性。
05
食品微生物检验技术展望
新技术与新方法的发展
基因组学技术
利用基因组学技术，如全基因组测序，能够 更精确地鉴定微生物种类，提高检测的灵敏 度和特异性。
免疫学方法
新型免疫学方法如酶联免疫吸附法和胶体金 免疫层析法等，具有快速、简便、灵敏度高 等优点，适用于现场检测和快速筛选。
自动化与智能化技术的应用
肉类食品中的微生物检验
总结词
肉类食品中的微生物检验主要关注沙门氏菌、弯曲菌、志贺氏菌等常见致病菌，以确保 肉类食品的安全性。
2024版年度食品微生物检验技术教学设计
通过食品微生物检验，可以及时发现并处理食品中的污染和变质问题，保障公众的健康和生命安全。
维护公众健康
食品微生物检验技术的发展和应用，有助于提高食品质量和安全水平，推动食品产业的健康发展。
促进食品产业发展
食品微生物检验重要性
教学目标与要求
掌握基本理论和技能
通过本课程的学习，学生应掌握食品微生物检验的基本理论和实验技能，包括微生物学基础知识、检验方法和技术等。
涵盖食品微生物学基础知识、检验原理和方法、实验操作规范等方面。
考试内容
根据教学目标和学生实际情况，合理设置考试难度，既要考察学生对基础知识的掌握，又要体现一定的分析、解决问题的能力。
难度把握
采用选择题、判断题、简答题、案例分析题等多种题型，全面评价学生的理论水平。
题型设置
理论考试内容设置及难度把握
安排一定学时的实验和实训课程，让学生在教师指导下进行实际操作，巩固所学知识和技能。
详细介绍食品微生物检验的常规方法和技术，如菌落总数测定、大肠菌群计数、致病菌检验等。
对课程内容进行总结和回顾，通过考核评估学生的学习成果和教学质量。
02
CHAPTER
基础知识与技能点梳理
了解微生物的基本概念、分类体系以及命名规则。
食品微生物检验技术教学设计
目录
课程背景与目标 基础知识与技能点梳理 实验操作技能培养方案设计 实验室安全与环保意识培养 案例分析与讨论环节设计 考核评价方式与标准制定 教学资源建设与利用策略 总结反思与持续改进计划
01
CHAPTER
课程背景与目标
食品微生物检验是确保食品安全的重要手段，能够及时发现和控制食品中的有害微生物，防止食源性疾病的发生。
培养基种类与选择
食品检验技术(微生物部分)教案文档
重点各种生化试验的原理、试验方法和试验结果的观察及记录。
难点各种生化试验的试验方法的掌握和如何利用试验结果来判别
各种生化试验的试验方法的掌握和如何利用试验结果来判别某种细菌此试验的阴阳性。
授课内容：
第一节微生物的生化试验
一、概述：
（一）、什么是生化试验；
（二）检验细菌的生化试验范围；
（三）生化试验的方法
授课时间
第二教学周
授课节数
3课时
教学目的：了解培养基的主要组成、作用和培养基的分类；
掌握培养基的制备技术；掌握无菌技术的概念、要求；
掌握微生物的接种与分离技术；了解微生物的培养方法；
了解微生物生长现象的观察及记录；
掌握细菌生化试验概念，生化试验的原理、试验方法和试验结果的观察记录。
授课章节：第三章培养基和实验基本操作技术：第一节培养基
(1)如何正确使用超净台?
(2)简述手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法
(3)在微生物实验室中如何配置培养箱,使用中要注意哪些问题?
(4)如何正确使用干热灭菌方法对玻璃器材进行灭菌?
(5)在微生物实验室中如何配置水浴锅,使用中要注意哪些问题?
(6)如何进行玻璃器皿的清洗和灭菌?
教学方法：面授
课后分析：
教案纸
二、常用玻璃仪器及用具
三、玻璃器皿的清洗和灭菌
(一)、新购的玻璃器皿
(二)、用过的玻璃器皿
（三）、玻璃器材的灭菌
第一节培养基
一、培养基中的主要成分及其作用
（一）、营养物质（二）、水
作业：1、食品的卫生标准内容包括哪些？
2、对食品进行微生物检验具有何意义？
3、食品微生物检验的范围包括哪些？
4、食品卫生标准中的微生物指标有哪些？
《食品微生物检验技术》课程标准 2
《食品微生物检验技术》课程标准课程名称：食品微生物检验技术 课程类型：专业核心课程 适用专业：食品营养与检测 课程学分：8 总学时：1441 课程定位食品微生物检验技术是食品营养与检测专业的一门工学结合的专业核心课程，是食品检验两大工作岗位群之一，实践性、技术性很强。
在掌握与食品卫生检验中的有关微生物特性的基础上，通过系统的检验方法，及时、准确地对食品样品作出食品卫生检验的报告，为食品安全生产及卫生监督提供科学依据。
2 课程目标1.能力目标1.1 掌握微生物检验过程中无菌操作规程；1.2 正确使用光学显微镜、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、均质器、超净工作台等微生物检验有关仪器和设备；基础化学食品生物化学食品检验校内生产训练食品微生物检验技术顶岗实习1、 食品微生物类群鉴别、测定技术；2、 食品微生物检验室建设；3、 食品卫生细菌学检验技术；4、 真菌学检验技术；5、 食品中常见病原微生物检验技术；6、 其他的微生物检验技术1.3 熟练掌握无菌操作技术、培养基制备技术、消毒灭菌技术、分离纯培养和接种技术、染色技术等微生物基本操作技能；1.4 掌握各类食品检样的菌落总数、大肠菌群、乳酸菌、霉菌和酵母菌、致病菌等常规项目的检测技术，能掌握罐头食品商业无菌的检验技术；1.5 熟练分析总结实验结果，并做出实验结果，并作出正确、规范的实验报告。
2.知识目标2.1 理解和掌握无菌操作技术特点，五大类微生物类群的形态特征，细菌的革兰氏染色的原理和方法，光学显微镜的工作原理和技术特点，培养基的配制原则和种类，微生物生长的规律以及影响微生物生长的因素；2.2 熟悉微生物检验的基本程序和要求；2.3 常规项目的检验的卫生学意义及检验程序；2.4 理解《中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法微生物部分》（简称国标）；2.5 熟悉常见致病菌的生物学特性，能在食品检验中进行致病菌的鉴别；2.6 检验新技术基本原理。
3.素质目标3.1 培养学生自觉学习新技术、新知识的能力；3.2 重视培养学生的诚信品质、敬业精神和责任意识、遵纪守法意识、团结合作意识；3.3 提高学生的实践能力、创造能力、就业能力。
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食品微生物学实验技术实验1 食品中细菌菌落总数的测定1 目的要求（1）掌握食品中菌落总数测定方法。
（2）了解食品清洁程度（被污染程度）及观察细菌在食品中繁殖的动态，从而为被检样品进行卫生学评价时提供依据。
2 基本原理菌落（colony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的细菌集团。
菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（g，cm2)检样中所含菌落总数。
通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colony forning unit。
菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度）的标记，通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。
反之，菌落总数就越高。
菌落总数的测定是以每个活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践中除了单个细胞形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。
由于菌落总数的测定是在37℃有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。
因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
但由于在自然界这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总数，正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。
3 实验材料3．1 仪器恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。
3．2 材料吸管（容量为0.1mL、1m和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。
3．3 试剂营养琼脂培养基、75%乙醇、0.85%生理盐水。
4 实验方法与步骤4．1 菌落总数实验程序（如图28-1）4．2 检样稀释及培养（1）以无菌操作将检样25g(25mL)剪碎放于装有225mL灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶，经过充分振荡或均质处理制作成1：10的均匀稀释液（固体食品有的需先用灭菌研钵研磨后再稀释）。
（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管（注意吸管尖端不要触及管稀释液），振摇试管混合均匀，作成1：100稀释液，按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
（3）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释液，分别在作10倍递增稀释同时，吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿，每个稀释度作两个平皿。
（4）稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生理盐水的灭菌平皿作空白对照。
（5）待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1℃温箱培养24+2hr（肉、乳和蛋品为48+2h，水产为30℃48+2h）。
4．3 菌落计数将培养24h后的平板取出，选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，取两个平板的平均数，乘以稀释倍数，即得每克（或毫升）样品所含菌落总数。
4．4 平板菌落计数方法(1) 平板菌落数的选择选取菌落数在30～300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，且一个稀释度应使用两个平板的平均数。
其中当一个平板有较大片状菌落生长时，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
(2) 稀释度的选择A．应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。
B．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300个之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若两者之比大于2，则报告其中较小的数字。
C．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
D．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最底的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
E．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于<1乘以最低稀释倍数报告之。
F．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
(3) 菌落数的报告菌落数在100以时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。
(见表28-1)表28-1 稀释度选择及菌落数报告方式例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数（cfu/g，mL）报告方式（cfu/g，mL）10-1 10-210-31 多不可计164 20 - 164000 16000或1.6×1042 多不可计295 46 1．6 37750 38000或3.8×1043 多不可计271 60 2．2 27100 27000或2.7×1044 多不可计多不可计313 - 313000 310000或3.1×1055 27 11 5 - 270 270或2.7×1026 0 0 0 - <1×10<107 多不可计305 12 - 30500 31000或3.1×1045 实验结果（1）将实验得到的菌落总数结果记入下表10-210-310-410-5备注12平均（2）报告所选两个稀释度之比及检测结果。
6 注意事项（1）若实验样品为食品，为防止食品碎屑混入琼脂影响计数，通常需在琼脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，每100mL加1mL0.5%TTC，培养后，如系食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。
（2）理论上讲，为了得到实验食品中所有细菌菌落总数，应将样品接种到几种不同的培养基中并培养在不同的条件下，所得到的细菌菌落数总和。
但根据国家颁发的不同食品的规定，都是根据用普通营养琼脂，37℃（水产品30℃）进行需氧培养的结果来确定的，而且这种测定确具代表性，因而菌落总数在一般卫生学评价中并不要求用不同培养基进行选择性培养。
（3）目前还有几种快速检测菌落总数的方法如由军事医学科学院研制而成食品细菌检验箱，菌落总数测定采用试管斜面计数法操作简便，不易受污染，结果与国标法平板计数一致。
另一种是3M提供的Petrifilm Plates测试片（菌落总数测试片）。
由于测试片中含有一种红色指示剂，使所有菌落易于识别计数，该片也可用于乳酸菌测定，48hr可确定菌落总数。
7 思考题（1）什么是菌落总数，何谓cfu？（2）若平板上菌落数生长一半较均匀，另一半呈片生长，如何计数菌落数？（3）影响杂菌总数准确性的因素有哪些？实验2 食品肠菌群的测定1 目的要求（1）学习与掌握食品肠菌群的测定方法。
（2）了解大肠菌群在食品卫生学检验中的意义。
2 基本原理大肠菌群系指一群在37℃24hr能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的埃希氏无芽孢杆菌。
它包括大肠埃希氏杆菌和柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌等类大肠杆菌。
大肠菌群的检测就是根据大肠菌群的定义，即利用它们能发酵乳糖产酸产气的特性而设计的初发酵实验；初发酵阳性管通过伊红美兰平板进行分离；复发酵对分离菌作证实实验的三步法。
根据证实为大肠菌群阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数（食品肠菌群系以每100mL（g）检样大肠菌群最可能数MPN表示），MPN最可能数是表示样品中活菌密度的估计。
3 实验材料3．1 仪器温箱、冰箱、恒温水浴、天平、微波炉、均质器、普通光学显微镜。
3．2 材料吸管（0.1mL、1mL和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、镊子、小倒管等。
3．3 培养基乳糖胆盐培养基，伊红美兰琼脂，乳糖发酵培养基，革兰氏染色液，0.85%生理盐水。
4 实验方法与步骤4．1 大肠菌群检验程序（如图29-1）4．2 检样稀释取检样25g(mL)剪碎，以225mL灭菌生理盐水稀释做成1:10稀释液，并依次做10倍递增稀释液，例如10-1，10-2，10-3，10-4等，估计样品污染程度，选择3个合适稀释液备用。
4．3 乳糖发酵试验将待稀释检样品接种乳糖胆盐发酵管，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36+1℃温箱培养24+2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，可报告为大肠菌群阴性。
如有产气者，则按下列程序进行。
4．4 分离培养用接种环挑取产气的乳糖胆盐发酵管划线接种在伊红美兰琼脂平板上，36+1℃温箱18～24h培养，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
典型的大肠埃希氏菌落呈紫黑色金属光泽，非典型大肠菌群有时为红色菌落。
4．5 证实试验在上述平板上，挑取带有黑色金属光泽的可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管36+1℃培养24+2h后观察产气情况。
凡乳糖管产气，革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。
5 实验结果应结果型菌落色结果应结果+或-1mL 1 2 30.1mL 1 2 30.01mL 1 2（2）根据证实为大肠菌群的阳性管数，查（MPN检索表后报告每100mL (g)大肠菌群的最可能数。
6 注意事项双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。
（1）初发酵实验与证实实验有时不一定符合。
凡初发酵的产气管一定要做伊红美兰平板分离。
如果平板出现典型的大肠菌菌落，G-染色阴性无芽孢菌，即可做出判定。
如果平板上典型菌落少，应多挑取菌落包括挑菌落中心黑红、灰红，以及红、粉红等菌落，在革兰氏染色的同时，做证实试验，以免出现假阴性。
（2）关于产气发酵管的小倒管如储留气体则是阳性结果，如果不存留气体，但液面及管壁可以看到缓慢上浮的小气泡，或者对没有气体产生的发酵管用手轻轻弹动试管，有气泡出现而且沿管壁上升，都应考虑可能是由菌发酵产生气体的缘故。
应做进一步观察，因为这种情况阳性检出率可达50%以上。
（3）所谓典型大肠埃希氏菌是指具有该菌所有生物学特性的大肠菌。
新近随粪便排出的大肠菌多属于这一类型。
所以如查出多量典型大肠埃希氏菌表明样品是粪便的近期污染结果。
研究表明，典型大肠菌随粪便排到外界环境中约一周后，典型菌可变为非典型菌。
这种变化以生化变异为主。
如果样品检测以非典型大肠菌为主，则指示样品受粪便的远期污染。
大肠埃希氏菌大量存在于人畜肠道，并随粪便排出。
本菌在粪便中数量多，易于培养，对外界的抵抗力与肠道致病菌比较相近，所以选择大肠埃希氏菌作为被粪便污染的指示菌，合理、科学。