第6章分子生物学研究法(下)
分子生物学研究
分子生物学研究引言分子生物学是现代生物学的一个重要分支，主要关注生物体内的分子机制。
通过研究核酸、蛋白质等大分子的结构和功能，科学家们能够揭示生命的奥秘。
本文将简要介绍分子生物学的研究内容、方法以及一些重要的研究成果。
研究内容1. 核酸研究核酸包括DNA和RNA，是遗传信息的载体。
分子生物学的重要任务之一就是研究核酸的结构与功能。
例如，DNA双螺旋结构的发现为理解遗传信息的存储和传递奠定了基础。
此外，RNA在基因表达调控中的作用也是研究的重点之一。
2. 蛋白质研究蛋白质是生命活动的主要执行者。
分子生物学研究蛋白质的合成、折叠、功能及其与其他分子的相互作用。
通过了解蛋白质的功能，可以更好地理解细胞的生理过程。
3. 酶学研究酶是一类具有催化作用的蛋白质，能加速生物化学反应。
分子生物学研究酶的结构、催化机制及应用，如在医药和工业上的应用。
4. 信号传导研究细胞通过复杂的信号传导网络进行通信。
分子生物学研究这些信号通路的组成、调控及功能，以揭示细胞间的信息交流机制。
研究方法1. 分子克隆技术分子克隆技术是分子生物学的基本工具，用于获取、扩增和改造特定基因。
常用的方法包括PCR（聚合酶链式反应）和质粒构建。
2. 基因编辑技术CRISPR-Cas9等基因编辑技术的发展，使科学家能够精确地修改基因序列，从而研究基因的功能和治疗遗传疾病。
3. 高通量测序技术高通量测序技术（如NGS）能够快速测定大量DNA或RNA序列，极大地推动了基因组学和转录组学的发展。
4. 结构生物学方法X射线晶体学、核磁共振（NMR）和冷冻电镜（Cryo-EM）等技术用于解析蛋白质和其他生物大分子的三维结构，为理解其功能提供重要信息。
重要研究成果1. DNA双螺旋结构的发现沃森和克里克于1953年提出DNA双螺旋结构模型，这一发现奠定了现代分子生物学的基础。
2. RNA世界假说RNA世界假说认为早期生命形式主要以RNA为基础，RNA既是遗传物质又具有催化功能，为理解生命起源提供了新的视角。
分子生物学研究法-基因功能研究技术
分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。
但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。
如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。
转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。
用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。
酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。
随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。
本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。
6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。
通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
(整理)分子生物学研究方法.
一．名词解释IP（免疫沉淀、免疫印迹）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot分析目的蛋白质。
这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。
NLS（核定位序列）：核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。
一般含有4～8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。
可分为单一型NLS和双分型NLS。
单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE 非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAA TKKAGQAKKKKLDK）。
SUMO（small ubiquitin-related modifier）：是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。
SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。
SUMO 化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。
二．问答题1.什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。
特性：①基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。
②遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
分子生物学 分子生物学研究法
5‘ 供者
探针
3‘ 受者
Taqman法 分子信标(molecular beacon)法
高效液相色谱 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法 DNA芯片技术（DNA chip）
SNP数据库
国立生物技术信息中心 德国的HGBAS网站
JST的数据库
2.5基因打靶(gene targeting)
通过DNA定点同源重组，改变基因组中 的某一特定基因，在生物活体内研究该 基因的功能。(反向遗传学)
抗原－抗体 特异性结合
SDS-PAGE 后转膜
基因表达产 物――蛋白
的检测
ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDSPAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。
Southern blot
Northern blot
Western blot
双脱氧法测序
gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行 到与DNA变性温度一致的凝胶位置时， DNA发生部分解链，电泳迁移率下降， DNA链中有一个碱基改变时，会在不同 的时间发生解链，因影响电泳速度变化 的程度而被分离。
荧光共振能量传递 (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
(NEW)朱玉贤《现代分子生物学》(第5版)笔记和课后习题(含考研真题)详解
4.3 名校考研真题详解 第5章 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术
5.1 复习笔记 5.2 课后习题详解 5.3 名校考研真题详解 第6章 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术 6.1 复习笔记 6.2 课后习题详解 6.3 名校考研真题详解 第7章 原核基因表达调控 7.1 复习笔记 7.2 课后习题详解 7.3 名校考研真题详解 第8章 真核基因表达调控 8.1 复习笔记 8.2 课后习题详解 8.3 名校考研真题详解
② T2噬菌体感染大肠杆菌实验
a．在分别含有35S和32P的培养基中培养大肠杆菌。
b．用上述大肠杆菌培养T2噬菌体，分别制备含35S的T2噬菌体和32P的
T2噬菌体。
c．分别用含35S的T2噬菌体和32P的T2噬菌体感染未被放射性标记的大 肠杆菌。
d．培养一段时间后，将混合液离心，检测子代噬菌体放射性。上清液 主要是噬菌体，沉淀物主要是大肠杆菌。
（4）基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划是一项国际性的研究计划，其目标是确定生物物种基因组所 携带的全部遗传信息，并确定、阐明和记录组成生物物种基因组的全部 DNA序列。
功能基因组学相对于测定DNA核苷酸序列的结构基因组学，其研究内容 是在利用结构基因组学丰富信息资源的基础上，应用大量的实验分析方 法并结合统计学和计算机分析方法来研究基因的表达、调控与功能，以 及基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的 相互作用和生物的生长发育等规律。功能基因组学的研究目标是对所有 基因如何行使其职能从而控制各种生命现象的问题作出回答。
严格地说，重组DNA技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他
可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。
分子生物学研究方法教案
分子生物学研究方法教案一、教学目标1、让学生了解分子生物学的基本概念和研究范畴。
2、使学生掌握常见的分子生物学研究方法，包括其原理、操作步骤和应用领域。
3、培养学生的实验设计能力和科学思维，能够运用所学方法解决实际问题。
二、教学重难点1、重点（1）PCR 技术的原理和应用。
（2）核酸电泳技术的原理和操作。
（3）基因克隆的基本流程。
2、难点（1）PCR 反应体系的优化和常见问题的解决。
（2）基因克隆中载体的选择和构建。
三、教学方法1、讲授法：讲解分子生物学研究方法的基本原理和关键步骤。
2、演示法：通过多媒体展示实验过程和结果，增强学生的直观感受。
3、讨论法：组织学生讨论实验设计和结果分析，培养学生的思维能力。
四、教学过程1、课程导入（1）通过介绍一些与分子生物学相关的疾病诊断、基因治疗等实际应用案例，引起学生的兴趣，引出分子生物学研究方法的重要性。
2、分子生物学研究方法概述（1）简单介绍分子生物学的定义和研究对象，如 DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。
（2）列举常见的分子生物学研究方法，如 PCR、核酸电泳、基因克隆、DNA 测序等。
3、 PCR 技术（1）原理：讲解 PCR 技术的基本原理，即通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数扩增。
（2）反应体系：介绍 PCR 反应体系的组成成分，包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等，并说明各成分的作用。
（3）操作步骤：详细讲解 PCR 的操作步骤，包括模板 DNA 的制备、引物设计、反应体系的配制、PCR 扩增程序的设置等。
（4）应用：举例说明 PCR 技术在基因诊断、遗传分析、物种鉴定等方面的应用。
4、核酸电泳技术（1）原理：解释核酸电泳的原理，即根据核酸分子在电场中的迁移速率不同来分离和鉴定核酸片段。
（2）琼脂糖凝胶电泳：介绍琼脂糖凝胶电泳的操作方法，包括凝胶的制备、样品的加载、电泳条件的设置等。
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6.1.4 基因定点突变技术
➢ 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的 氨基酸序列，用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白 质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。
➢ 基因定点突变也可用于改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
➢ 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚 核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。
✓ 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条 为突变型子链。
✓ 将获得的双链分子通过转导导入宿主细胞，并筛选出突 变体，其中基因已被定向修改。
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➢操作流程：
✓合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物。 ✓ 构建含靶序列的单链重组 M13DNA。 ✓ 用DNA聚合酶延伸诱变寡 核苷酸引物，形成杂合双 链M13DNA。 ✓ 转染大肠杆菌，筛选携带 突变体克隆的M13噬菌斑。 ✓ 纯化突变体，序列序列分 析验证。
➢ 目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种 PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。
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1)寡核苷酸定点突变 ➢ 原理：
✓ 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要 改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对。
✓ 合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完 全互补。
✓ 用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链DNA的 复制。
➢ 转录组 广义上指在特定生理条件或环境下，一个 细胞、组织或生物体中转录出来的所有RNA的集 合，包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。
➢ 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA。 ➢ 通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来描述
基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度， 是目前基因表达研究的基本思路。 ➢ 转录组研究的基本方法包括)重叠延伸PCR诱变法 ➢ 原理：
✓ 对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和 复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合 的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和 模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链。
➢ 操作流程：
✓ 将DNA模板分别与引物对1和引物对2退火。 ✓ 通过PCR1和PCR2扩增出两种靶基因片段。 ✓ FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火。 ✓ 用DNA聚合酶补平缺口，形成长链DNA，PCR3扩增。 ✓ 用引物F2和R2扩增出带有突变位点的全长DNA片段。
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1)表达序列标签测序(EST) ➢ 原理：
✓ EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5端和3端单 向一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整 基 因 的 一 小 部 分 ， 在 数 据 库 中 其 长 度 一 般 从 20 到 7000bp不等，平均长度为360±120bp。
✓ EST 来 源 于 一 定 环 境 下 一 个 组 织 水平。
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3)转录组高通量测序(RNA-Seq) ➢ 原理：
✓所有的高通量测序技术都 能进行RNA测序。
✓ 对cDNA进行高通量测序， 以 获 得 来 不 同 mRNA 片 段 在特定样本中的含量。
✓各种类型的转录本都可以 进行高通量检测。
➢ 操作流程： ✓ 数据分析
第6章分子生物学研究法(下)
第6章 分子生物学研究法(下)
——基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其他分子生物学技术
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6.1 基因表达研究技术
6.1.1 转录组测序
定特定的DNA序列在染色体上的位置。
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➢ 原理：
✓ 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性 或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体 上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分 子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色 体上的位置显示出来。
➢ 操作流程：
✓ 以经过标记的已知核酸分子为探针。 ✓ 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子。 ✓ 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交。 ✓ 再对其探测。
➢ 操作流程：
✓ 以寡聚dT为引物反转录合成cDNA，用锚定酶酶切。 ✓ 将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。
每一种接头都含有标签酶酶切位点序列. ✓ 用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接
两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和 B扩增。 ✓ 用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。 ✓ 对标签数据进行处理。
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6.1.3 原位杂交技术
➢ 原位杂交技术(ISH)是用标记的核酸探针，经放射 自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的 一种手段。
➢ 原位杂交分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。 ➢ RNA原位杂交 组织切片中，对特定基因的表达产
物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析。 ➢ 染色体原位杂交也称为荧光原位杂交(FISH) 可确
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6.1.2 RNA的选择性剪接技术
➢ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
➢ 选择性剪接可分为：平 衡剪切、5选择性剪切、 3选择性剪切、外显子 遗漏型剪切及相互排斥 型剪切。
➢ 常 用 RT-PCR 法 研 究 某 个基因是否存在选择性 剪切。
➢ 操作流程：
✓ 组 织 样 品 mRNA 的 提 取 → 逆 转 列分析(SAGE) ➢ 原理:
✓ SAGE是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表 达丰富度不同的SAGE标签序列。
✓ 通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过 PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。