生物反应器
生物反应器
3种酵母表达系统
• 甲醇营养型酵母表达系统：巴斯德毕赤酵 母(Pichia pastoris)表达系统最为常用；
• 巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如 信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和 糖基化作用等，其糖基化位点其他哺乳动 物细胞相同，适合于生产医药用重组蛋白 质。
3种酵母表达系统
• 裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许 多与高等真核细胞相似的特性，它所表达 的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构 象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较 少。
动物细胞生物反应器
• 昆虫细胞； • 哺乳动物细胞； • 鱼类细胞。
昆虫细胞生物反应器
• 昆虫杆状病毒表达系统( BEVS)： 病毒载体、昆虫细胞、宿主培养基； 与细菌 、酵母、 哺乳动物细胞表达系统相比，
具有易于操作和筛选， 较好的转录后加工 修饰以及安全等优点； 缺点：昆虫细胞的蛋白质加工过程并非同高 等的真核生物完全一致， 最终会影响到表 达产物的生物学活性。
家蚕丝腺生物反应器
• 家蚕是人工养殖的经济昆虫， 蚕的丝腺作 为生物反应器来表达重组的外源蛋白具有 极高的商业价值与应用前景。
家蚕丝腺生物反应器
• 存在的问题： 丝腺中主要以丝蛋白分泌为主，给目的蛋白
的下游分类纯化带来了困难； 与杆状病毒表达系统一样存在蛋白质转录后
修饰的问题； 如何将外源基因稳定的转入家蚕体内，同时
• 真核单细胞、结构简单、 因序列已经完全测 得, 序列结构比较清楚, 利于遗传操作;
• 培养条件简单, 可以大规模培养, 易于工业化 生产; 核转化与叶绿体转化方法成熟;
• 衣藻作为真核生物, 可以对真核蛋白质进行准 确的翻译后加工修饰( 如: 正确的折叠等) ;
• 衣藻本身不带有对人体有害的生物, 如病毒、 细菌等, 这就使得其表达的产物不会含有毒素 等有害物物质, 从而减少纯化步骤, 大大降低成 本。
生物反应器
生物反应器指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备，它是生物反应过程中的关键设备。
生物反应器的结构、操作方式和操作条件的选定对生物化工产品的质量、收率（转化率）和能耗有密切关系。
生物反应器的设计、放大是生化反应工程的中心内容，也是生物化学工程的重要组成部分。
分类从生物反应过程说，发酵过程用的反应器称为发酵罐；酶反应过程用的反应器则称为酶反应器。
另一些专为动植物细胞大量培养用的生物反应器，专称为动植物细胞培养装置。
发酵罐发酵罐若根据其使用对象区分，可有：嫌气发酵罐、好气发酵罐、污水生物处理装置等。
其中嫌气发酵罐最为简单，生产中不必导入空气，仅为立式或卧式的筒形容器，可借发酵中产生的二氧化碳搅拌液体。
若以操作方式区分，有分批操作和连续操作两种。
前者一般用釜式反应器，后者可用连续搅拌式反应器或管式及塔式反应器。
好气发酵罐按其能量输入方式或作用原理区分，可有：①具有机械搅拌器和空气分布器的发酵罐这类发酵罐应用最普遍，称为通用式发酵罐。
所用的搅拌器一般为使罐内物料产生径向流动的六平叶涡轮搅拌器，它的作用为破碎上升的空气泡和混合罐内的物料。
若利用上下都装有蔽板的搅拌叶轮，搅拌时在叶轮中心产生的局部真空,以吸入外界的空气,则称为自吸式机械搅拌发酵罐。
②循环泵发酵罐用离心浆料泵将料液从罐中引出，通过外循环管返入罐内。
在循环管顶端再接上液体喷嘴，使之能吸入外界空气的,称喷射自吸发酵罐。
③鼓泡塔式发酵罐以压缩空气为动力进行液料搅拌，同时进行通气的气升发酵罐。
目前，世界所发展的大型发酵罐是英国卜内门化学工业公司的发酵罐，它以甲醇为原料生产单细胞蛋白的压力循环气升发酵罐,其直径为7m，高为60m，总容量为 2300m□，自上至下有5000～8000个喷嘴进料。
目前，还有些发酵产品，如固体曲等，使用专门设计的能调节温、湿度的旋转式固体发酵装置。
生产甲烷（沼气）用的是嫌气发酵罐，也称消化器或沼气发生器，这种发酵罐装有搅拌器，顶部有的有浮顶。
生物反应工程 第7章 生物反应器
将列管并列焊接在一起，组成挡板; [2]
直接利用列管当挡板
H—筒身高度 D—罐径 W—挡板宽度 HL—液位高度 Di—搅拌器直径 S—两搅拌器间距 B—下搅拌器距底 间距
1.罐体
结构：圆柱体和椭圆封头或碟形封头焊 接而成。小型发酵罐罐顶和罐身采用法 兰连接。顶部设有清洗用的手孔。
材料为碳钢或不锈钢。大型发酵罐可用 不锈钢或复合不锈钢制成。小大型发酵 罐可用不锈钢或玻璃钢制成。 刚度和强度：受压容器，空消或实消， 通常灭菌的压力为2.5Kg/m3。
生物催化剂在反应器中的分布方式 生物团块(包括细胞、絮凝物、菌丝体)反应 生物膜反应器两大类。 固相催化剂的运动状态来分类 填充床 流化床 生物转盘等多种型式反应器。 按反应体系的相态来分类 均相——可溶的酶催化反应 非均相
•反应物系在反应器内的流动与混合状态 （反应器内流体的流动类型） 活塞流反应器 (continuous plug flow reactor， CPFR ) 全混流反应器( continuous stirred-tank reactor，
表 通用式发酵罐的几何尺寸与操作条件
几何尺寸与操 作条件范围 H/D=1～4
Di/D=1/2～1/4 W/D=1/8～1/12 B/ Di =0.8～1.0
搅 拌 转 速 N=30 ～ 1000 (r/min) 单位醪液体积的冷却面 积0.6～1.5 (m2/m3)
典型数值
奥地利某公司 200m3
4.温度控制系统：
电极、热交换装置和及其控制 排除发酵过程中由于生物氧化作用及机械 搅拌产生的热量的装置 在发酵过程中，放出的热量可用如下的热 平衡方程式：
Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射
《生物反应器》课件
。
新药研发中的应用实例
01
药物筛选
利用生物反应器进行药物筛选， 寻找具有药效的化合物或微生物 。
药物合成
02
03
药物改造
通过生物反应器合成药物，如蛋 白质、多糖等，提高药物的生产 效率和纯度。
利用生物反应器对药物进行改造 ，如蛋白质工程、基因工程等， 提高药物的疗效和安全性。
05
生物反应器的发展趋势与挑战
生产成本
生物反应器的生产成本较高，需要采取有效措施降低成本，提高经济 效益。
人才短缺
生物反应器技术的发展需要大量的专业人才和技术工人，但目前市场 上相关人才短缺，制约了产业的发展。
生物反应器的未来展望
广泛应用
随着生物技术的不断发展和 应用领域的扩大，生物反应 器将在医药、食品、化工等 领域得到更广泛的应用。
生物反应器应能高效地进行生物反应，确保 高转化率和产物浓度。
适应性原则
生物反应器应能适应不同的生物反应需求， 具备灵活性和可扩展性。
稳定性原则
生物反应器应具备稳定的操作性能，保证反 应的连续性和可靠性。
易于维护原则
生物反应器应便于清洁、维修和保养，降低 运营成本。
生物反应器的优化目标
提高转化率
通过优化反应条件和操作参数，提高生物反 应的效率。
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01
温度
维持适宜的温度，保证微生物的正 常生长和代谢。
溶解氧
维持适宜的溶解氧浓度，以满足微 生物的需氧需求。
03
02
pH值
维持适宜的pH值，保证微生物的正 常生长和代谢。
底物浓度
控制底物浓度，以调节微生物的生 长和产物生成。
04
生物反应器的效率评估
第四章 生物反应器
3、发酵罐冷却面积的计算 发酵罐冷却面积的计算可按传热基本方程式来确定，即：
F
式中
Q K t m
F：冷却面积(米2) Q：总的发酵热(焦耳/小时) K：传热总系数(焦耳/米2.小时.℃) Δtm：对数平均温度差(℃)
二、 啤酒发酵设备
方向发展： 大 型（最大1500吨 ）
室 外（减少投资、易于改造）
内循环
外循环
第二节Biblioteka 厌氧（嫌气）发酵生物反应器
应用范围： 酒精、 啤酒、 丙酮丁醇
发展方向： 罐体——大型化 操作——连续化 控制——自动化
一、酒精发酵设备
（一）对酒精发酵罐的要求
满足工艺要求，有利于发酵热的排出； 从结构上有利于发酵液的排放； 有利于设备清洗、维修以及设备制造安装方便等问题； 有利于进行二氧化碳回收。
5、能获得最大的生产效率与最佳的经济效益。
生物反应器的分类：
1、按培养生物类型：
微生物反应器、动物细胞反应器、植物细胞反应器、酶促反应器 2、按培养方式： 通气生物反应器、厌气生物反应器、光照生物反应器、膜生物反应器 3、按生物反应器结构：
罐式、 管式、 塔式、 池式、膜式
4、按操作方式： 间歇式、连续式、半连续式
由于当代发酵工业的发展，大规模悬浮培养微生物（液 态深层培养）已成为生物工业获得产品的最主要手段，通常 把此类微生物反应器统称为发酵罐。
根据微生物是否应通气培养，将发酵罐分为通风发酵罐 和厌气发酵罐。
发酵罐的基本条件
1. 应具有适宜的径高比。发酵罐的高度与直径比约为1.1- 4 (视具体 的罐型而定。如：由于罐身长，氧的利用率较高，因此对于通风发酵设
生物反应器
生物反应器生物反应器是一种生物技术设备，主要用于生物发酵、生物转化和生物固定化等过程的实现，是生物技术学领域中的核心设备之一。
生物反应器按规模大小可分为实验室规模、小型工业规模、大型工业规模及超大型规模，广泛应用于生物制药、食品工业、环保工程、化工领域及实验室研究等不同领域。
本文主要介绍生物反应器的基本概念、分类、结构、功能与应用等方面的内容。
一、生物反应器的基本概念生物反应器是一种专门用于维持和促进生物体生长繁殖，并对物质能量进行转化的设备。
是利用微生物生长代谢的能力，进行化学制品或生物制品的生产。
反应器内部常温度、氧气含量、pH值、营养物浓度等参数进行监测与控制，以维持接近理想的生长环境，从而提高微生物总体产量和单独化合物的产量。
二、生物反应器的分类按微生物名称分为真菌反应器和细胞反应器两种；按操作条件分为常压和高压反应器两种；按反应器内混合方式分为不同类型，如机械混合反应器、气液混合反应器、液相连续搅拌反应器、固相悬浮式反应器等；按生产工艺分则有批量式反应器、半连续式反应器和连续式反应器等。
三、生物反应器的结构生物反应器结构包括传质层、反应层和生物活性层三个部分。
传质层由反应器外壳和传质器件（气体传输系统与吸收液传输系统）组成，热量传递和质量传递的效率决定于传质器件的选择和设计。
反应层由反应器罐体、搅拌器、传热器、控制仪等组成，其内部环境的压力、温度、营养物浓度、气相浓度、氧含量、pH值等参数决定了反应的产物和效率。
生物活性层是一个重要的环节，是水生生物或微生物参与反应的主要部分。
其中，微生物是生物活性层的核心，它们根据营养状态发生生长、代谢和能量转换等复杂的反应，完成指定的反应目的。
四、生物反应器的功能生物反应器的主要功能是实现微生物生长代谢和化学过程，从而获得所需的生物制品或化学成品。
其次，需要满足反应器内环境的生物学和物理学参数要求，如空气、水、营养物、pH、pO2、温度、压力、流量等参数，确保最大的反应效率和最佳的反应条件。
第一章 生物反应器
测定菌体湿重或干重法：
此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的 。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测 定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来， 经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微 生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出 湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在 已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放 人干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。 如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌 ，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用 50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的 湿重或干重。
(4) 理想流动与非理想流动 ：主要是较大 得反应器由于混和，传热等需要时间，其内部往 往是不均一的。
两种理想流动模式：全混式和活塞流式。
全混式和活塞流式:
全混式:反应器各点浓度及其它 条件均一;
活塞流式:反应器内各物质沿一
定方向流动,完全没有反向混合.
非结构模型
结构模型
(最理想情况） 均衡生长（假设） 细胞之间无差异 细胞内有多个组 非离散模型 把细胞群体处 分（结构） 理为一种溶质
显微镜直接计数法：
显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球 计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观 的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个 平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各 刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方 格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一 个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪 种每个大方格中的小方格都是 400个。每一个大方格边长为 0 ． 1mm， 所以计数室的容积为 0．1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体 (孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得 出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个 中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板， 则计算方法为： lml 菌 液 中 的 总 菌 数 = 平 均 每 个 中 格 中 菌 的 个 数 ×25×104×M=50000N· M(个)
生物反应器归类
生物反应器归类
生物反应器是一种用于承载和促进生物反应的装置或体系。
根据反应
器的实际应用和操作原理，可以将生物反应器分为几个类别。
1. 发酵反应器：用于微生物发酵过程的反应器，用于生产食品、饲料、药物和生物燃料等。
常见的发酵反应器包括批式发酵罐、连续式发酵
罐和气体提升式发酵罐。
2. 培养反应器：用于细胞培养和组织工程的反应器，用于生产生物药
物和细胞制品。
常见的培养反应器包括摇床培养器、旋转培养器和悬
浮培养反应器。
3. 污水处理反应器：用于处理废水和污水中的有机物和有毒物质。
常
见的污水处理反应器包括活性污泥法反应器、膜分离法反应器和生物
滤池。
4. 生物酶反应器：用于生产酶类产物和催化生物酶反应的反应器。
常
见的生物酶反应器包括固定床反应器、悬浮式反应器和液体-液体界面
反应器。
5. 生物电化学反应器：用于转化生物质和废弃物为电能的反应器。
常
见的生物电化学反应器包括微生物燃料电池、微生物电解池和生物燃
料池。
以上是一些常见的生物反应器类别，各类反应器在不同领域有广泛应用，以满足人类对食品、药物、能源和环境保护等方面的需求。
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生物反应器
光生物反应器（ Physcomitrella patens）
生物反应器的概念
• 能够产生生物活性物质的生物体，也称为生 物反应器。 • 生物反应器包括以下几种: 细菌生物反应器； 酵母生物反应器； 发酵罐 细胞生物反应器； 藻类基因工程； 转基因动物生物反应器。
细菌生物反应器
• 细菌作为反应器，是最早使用的转基因生 产技术。目前，细菌仍然作为一种廉价高 效的表达重组外源蛋白的宿主在广泛使用。 大肠杆菌表达目的基因遗传背景比较清楚， 易于控制。另外，大肠杆菌容易培养，可 以获得高产量的目的蛋白。
酵母生物反应器的缺点
• 在酵母表达系统中部分外源基因不能表达； • 内部降解和多聚体形成； • 蛋白质高级结构不正确、翻译后加工、修 饰等不正确限制。
3种酵母表达系统
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系 统：酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率 低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋 白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确 糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。 因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表 达的宿主菌。
3种酵母表达系统
• 甲醇营养型酵母表达系统：巴斯德毕赤酵 母(Pichia pastoris)表达系统最为常用；
• 巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如 信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和 糖基化作用等，其糖基化位点其他哺乳动 物细胞相同，适合于生产医药用重组蛋白 质。
3种酵母表达系统
• 裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许 多与高等真核细胞相似的特性，它所表达 的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构 象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较 少。
鸡输卵管生物反应器
优点：鸡具有世代周期短、低成本、繁殖力 高、卵中天然存在着蛋白酶抑制剂和良好 的无菌环境； • 鸡的蛋清是一种相对简单的混合物，单个 鸡蛋卵清蛋白含量约为3.6 g，仅包括约11 种主要的蛋白，因此利于纯化；
• 与哺乳动物相比，一些鸡蛋白的糖基化方 式比哺乳动物更近似人类。
鸡输卵管生物反应器
质粒表达载体
• Invitrogen公司的pcDNA系列载体。
CMV: Cytomegalovirus, 能在哺乳动物细 胞中表达，不具 有组织或细胞特 异性。
细胞系和细胞株
• 原代培养物经首次传代成功即称为细胞系 （Cell Line），因此细胞系可泛指一般可能 传代的细胞。 • 其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系 或无限细胞系，不能连续培养的称为有限 细胞系。
• 缺点：蛋白质高级结构不正确、无翻译后 加工、无修饰等限制。
表达载体
• Novagen公司的PET系列载体。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（简称IPTG）是经 常被用来作为乳糖操纵子的诱导物。
乳糖操纵子的应用
乳糖操纵子的应用
最早应用基因工程生产人的蛋白
质的方法是在细菌中表达人的胰 岛素(1982)。
转基因动物乳腺特异性表达的启动子
• 乳球蛋白( BLG) 基因启动子； • 酪蛋白基因调控序列， 常用牛 αS1-酪蛋白 基因和羊β -酪蛋白基因的调控序列； • 乳清酸蛋白( WAP) 基因启动子； • 乳清白蛋白基因启动子。
乳腺生物反应器产业化
• 重组人抗凝血酶Ⅲ ( ATryn)已经被美国FDA批准 上市；
哺乳动物细胞、鱼类 细胞生物反应器
• 表达具有天然活性蛋白的最佳宿主。
• 其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的 合成、 加工和分泌信号 , 能准确地完成糖 基化、磷酸化 ，形成链内和链间二硫键以 及蛋白水解等翻译后加工过程 ,因而产生的 完整蛋白和天然蛋白一样。
• 缺点：产量低、成本高、需要严格灭菌的 培养条件。
生物反应器（Bioreactor）
生物反应器的概念
• 用微生物、植物、动物、人细胞或者专一性 酶， 通过生物方法将原料转化为特定产品 的容器称为生物反应器( Bioreactor) 。
• 胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反 应器。食物在胃里经过各种酶的消化，变成 我们能吸收的营养成分。
生物反应器
家蚕丝腺生物反应器
• 家蚕是人工养殖的经济昆虫， 蚕的丝腺作 为生物反应器来表达重组的外源蛋白具有 极高的商业价值与应用前景。
家蚕丝腺生物反应器
• 存在的问题：
丝腺中主要以丝蛋白分泌为主，给目的蛋白 的下游分类纯化带来了困难；
与杆状病毒表达系统一样存在蛋白质转录后 修饰的问题；
如何将外源基因稳定的转入家蚕体内，同时 能高效稳定地在丝腺细胞中表达也是亟待 解决的技术难关。
• 真核单细胞、结构简单、 因序列已经完全测 得, 序列结构比较清楚, 利于遗传操作; • 培养条件简单, 可以大规模培养, 易于工业化 生产; 核转化与叶绿体转化方法成熟; • 衣藻作为真核生物, 可以对真核蛋白质进行准 确的翻译后加工修饰( 如: 正确的折叠等) ; • 衣藻本身不带有对人体有害的生物, 如病毒、 细菌等, 这就使得其表达的产物不会含有毒素 等有害物物质, 从而减少纯化步骤, 大大降低成 本。
• 蛋清的一半蛋白来自两个卵清蛋白等位基 因，其特异表达于输卵管膨大部的管腺细 胞。
现状： 研究还处于初级阶段。
乳腺生物反应器
通过转基因技术 将乳腺组织特异性启动子
驱动的外源基因 在动物乳腺组织高效表达 通过乳汁分泌到体外 该方式不会对动物自 身机体造成损害通过回收乳汁就可以提取 有重要价值的生物活性酶 III( ATryn) ，每年市值7 亿美元；
• 5种药进入临床Ⅲ期试验；
• 37 种进入Ⅱ期临床研究阶段。
乳腺生物反应器面临的问题
• 生产周期长、基因整合效率不高； • 转基因动物死亡率较高； • 常出现不育导致转基因动物续代难。
莱茵衣藻生物反应器
动物细胞生物反应器
• 昆虫细胞； • 哺乳动物细胞； • 鱼类细胞。
昆虫细胞生物反应器
• 昆虫杆状病毒表达系统( BEVS)： 病毒载体、昆虫细胞、宿主培养基； 与细菌 、酵母、 哺乳动物细胞表达系统相比， 具有易于操作和筛选， 较好的转录后加工 修饰以及安全等优点；
缺点：昆虫细胞的蛋白质加工过程并非同高 等的真核生物完全一致， 最终会影响到表 达产物的生物学活性。
胰岛素是一种控制糖代谢的 蛋白质激素。缺乏糖尿病， 注射胰岛素。 现已在细菌中生产10多种 药品，例如表皮生长因子、 人生长激素、干扰素、乙 型肝炎工程疫苗等。
不同目的选择不同的菌株
• • • • DH5α; JM109; TOP10; BL21(DE3)……
酵母生物反应器
• 单细胞低等真核生物、遗传背景清晰、培养条 件普通、生长繁殖速度迅速、表达量高； • 用于表达基因工程产品时，可以大规模生产， 有效降低了生产成本； • 我国目前肝疫苗主要还是以酵母作为反应器来 生产的； • 酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力， 收获的外源白质具有一定程度上的折叠加工和 糖基化修饰， 性质较原核表达的蛋白质更加 稳定。
植物生物反应器
• 以植物悬浮细胞培养或整株植物为加工场 所大量生产具有重要功能或药用价值的蛋 白、人或动物的疫苗 抗体、重要的氨基酸 等；
• 相关植物生物反应器产品可通过种子、果 实或块茎表达，便于贮藏 运输和利用。
利用植物生物反应器制备抗体
• 抗肿瘤抗体； • 肿瘤疫苗； • 其它抗肿瘤药物。 缺点： • 重组蛋白表达量低； • 重组蛋白的免疫原性不够强；