DNA琼脂糖凝胶电泳制备全过程图解
生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析分析
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加电泳缓冲液
准备样品
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照
相
DNA琼脂糖凝胶电泳
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝
胶 ——分离、鉴定、纯化DNA
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解
离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时 向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分
子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分
子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片 段检测其大小的目的。
实验原理
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium
bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带, 从而可以确定DNA片段在凝胶 中的位置。
此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA
条带, 用于以后的克隆操作。
状DNA>开环DNA
DNA片段越长，泳动速度越慢
在低电压时，泳动速度与电场强度成正比
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（W/V,%） 分离范围（kb）
0.3
0.6 0.7 0.9 1.2
5-60
1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6
1.5
2.0
0.2-4
0.1-3
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
胶浓（%） 0.6 溴酚蓝 b 0.15kb
2kb
1.6kb
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝
琼脂糖凝胶电泳操作步骤
实验原理、材料、方法、结果、讨论琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相PCR-SSCP聚合酶链反应单链构象多态性PCR实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA 聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。
介绍：PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
PCR-SSCP分析的基本程序：1、通过PCR扩增特定靶序列，2、将扩增产物变性为单链，3、进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
PCR反应体系：（单位：微升）Buffer液： 2.5引物1： 1引物2： 1dNTP: 2模板DNA： 1双蒸水： 16.5Taq DNA聚合酶： 1非变性聚丙烯酰胺凝胶:1、30%聚丙烯酰胺（交联度49:1） 4ml，2、50×TAE缓冲液 0.2ml，3、1%TEMED 1ml5、蒸馏水 4.7ml，4、10%过硫酸铵（AP） 0.1ml银染步骤：1、电泳结束，小心取出凝胶，置10%乙醇液中固定5分钟。
（防止再扩散）2、置凝胶于1%硝酸氧化3分钟。
（预处理）3、用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。
4、置凝胶于0.012mol/L硝酸银液中20分钟。
使银离子与DNA结合。
5、弃去硝酸银，用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。
6、用0.019%甲醛液，含0.28mol/L无水碳酸钠使胶还原，银离子变成银颗粒而显色。
直至所需的显色深度。
7、置凝胶于10%冰乙酸停止还原反应。
DNA凝胶电泳
DNA凝胶电泳
制胶，铺胶
材料工具：制胶模板，TAE或TBE缓冲液，TAE专用瓶，Aarose I-H，配DAB瓶，微波炉应用液制备：取200ml 5×TBE缓冲液到TAE专用瓶中；
向瓶中加水，使液面到1000ml处
取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子；
取Aarose I-H 3g至“配DAB瓶”中；
向瓶中加入200ml应用液，混匀液体；
将盖子斜放于瓶口，将瓶置于微波炉中，火力设定10，时间3min；
取出瓶，加入10ul 10ug/ul EB，滴加时枪头置于液面以下，吹打几次，尽量完全打出；将瓶放置几分钟，使瓶中液体降温到65℃左右；
将琼脂糖凝胶液小心均匀地倒入内槽玻璃板，尽量一次铺胶，减少补胶行为的出现，倒入量为使液面距离板梳5mm处左右；
室温静置，待凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，铲掉多余凝胶，将制好的凝胶板放置于保鲜盒中保存；
加样：
向电泳槽中加入应用液，应用液应为制胶时使用的应用液；
将制好的凝胶板放置于电泳槽中，方向为从负极到正极即加样孔在靠近负极方向，应用液的量需要满足将凝胶板完全淹没,注意排出加样孔中气泡；
取加样板，在板上滴加2ul 6×上样缓冲液，每滴之间距离大于1cm；
取10ul DNA样品，滴加到上样缓冲液滴中，用枪吹打混匀，吸取10ul混合液垂直滴加到胶板小槽内，加样时注意不要破坏样品孔周围的凝胶；
开启电源，设置电压 120~140V
时间 30~40分钟
当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳；
取出凝胶板，置于紫外灯下观察，采用凝胶成像系统拍照保存。
DNA琼脂糖凝胶电泳制备全过程图解
铺胶
精品课件
凝胶凝固后取出梳子
精品课件
加缓冲液
精品课件
准备样品
精品课件
点样
精品课件
电泳
精品课件
注意观察溴酚蓝染液的迁移
精品课件
紫外灯下观察电泳结果
精品课件
照相
精品课件
DNA琼脂糖凝胶电泳
精品课件
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型
凝胶 ——分离、鉴定、纯化DNA 影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构
象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成 缓冲液pH>DNA Pi，DNA带负电荷，迁移率与
分子量对数成反比 DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA>线
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
精品课件
电泳槽结构
精品课件
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
精品课件
溶胶
精品课件
准备胶槽
精品课件
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
状DNA>开环DNA精品课件来自同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（%）
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-4
精品课件
分离范围（kb）
琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光 精品课件
主要实验器材
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下:1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65?左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止 .3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存实验原理闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA(cccDNA)、线性质粒DNA(L-DNA)和开环质粒DNA(ocDNA)。
实验材料和试剂(一)实验样品质粒pUC118(二)试剂1(l DNA/HindIII分子量标准2(溴酚蓝指示剂点样缓冲液0.2% 溴酚蓝50% 蔗糖3(1mg/ml溴化乙锭溶液4(电泳缓冲液(TAE)40 mmol/L Tris-乙酸1 mol/L EDTA(配制方法:24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml)5(0.7% 琼脂糖凝胶(配制方法:称取琼脂糖0.35克，加入50ml TAE电泳缓冲液)(三)仪器微量移液器电泳仪水平电泳槽透射紫外观察仪实验步骤1(选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤物品准备水平电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪、锥形瓶、琼脂糖、电泳缓冲液(1xTBE) 溴化乙锭(EB)溶液、上样缓冲液等实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。
在pH值为8.0- 8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料(如EB )后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
实验步骤（1）准备制胶架，用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子（2）配制琼脂糖凝胶及倒胶，琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围a.以1%的胶为例，三角瓶内0.6g琼脂糖+60ml(0.5xTBE)煮胶溶解冷却至60C(不烫手)b.加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5ug/ml）或按照1ul/30mL的比例加入DNAgreen 染料，并充分混匀。
c.倒板,小胶倒入25-30ml左右琼脂糖溶液，大胶则60-70ml左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。
d.室温下充分凝固，大约30分钟-1小时e.垂直向上拔出梳子f.将胶板放入电泳槽g.向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1-2nm.（3）加样将DNA样品(5ul)与6X上样缓冲液( 1ul)混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内，上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40ul为上限，大孔200ul为上限，具体和制胶膜规格相关）。
注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。
每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。
（4）电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为5V/cm (长度以两个电极之间的距离计算)，一般控制电压保持在110v，电流在40mA以上。
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤脂糖凝胶泳是用于分别、定和提DNA 片段的准方法。
脂糖是从脂中提取的一种多糖，具水性，但不荷，是一种很好的泳支持物。
DNA 在碱性条件下〔pH8 0 的冲液〕荷，在中通凝胶介向正极移，不同样 DNA 分子片段由于分子和构型不同样，在中的泳速率液不同样。
溴化乙〔 EB〕可嵌入 DNA分子碱基形成光合物，紫外照射后，可分出不同样的区，到达分别、定分子量，重子的目的。
⋯一、实验目的学习和掌握琼脂糖电泳法判断DNA 的原理和方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是用于分别、判断和提纯DNA 片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA 在碱性条件下〔的缓冲液〕带负电荷，在电场中经过凝胶介质向正极搬动，不同样DNA 分子片段由于分子和构型不同样，在电场中的泳动速率液不同样。
溴化乙锭〔EB〕可嵌入 DNA 分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同样的区带，到达分别、判断分子量，精选重组子的目的。
三、实验资料实验 14 提取的 DNA 样品，四、器具及药品电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠， EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。
五、实验步骤1、安装电泳槽将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的张口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。
2、琼脂糖凝胶的制备称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，〔按的琼脂糖含量，1-25kb 大小的 DNA 用1%的凝胶，20-100kb 的 DNA 用%的凝胶， 200-2000bp 的 DNA 用 %的凝胶〕置微波炉或沸水浴中加热至完好溶化〔不要加热至沸腾〕，取出摇匀。
3、灌胶将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内参加电泳缓冲液，尔后拔出梳子。
5、加样将 DNA 样品与加样缓冲液〔 loading buffer 〕按 4： 1 混匀后，用微量移液器将混杂液加到样品槽中，每槽加 10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
袱演芒厌弱磨箍溃蚁乙芹挝鸵亥圣龚引帐哪屹哺桔指致艳怕甭宰毫扎戊爸质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
（3）胶浓度 （4）电场强度：根据需要选择合适电压。 为了尽快得到实验结果，所用电场强度约为5V/cm， 但分辨率不高。 精确测定DNA分子大小时，电压1V/cm。 （5）溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂。
5、 DNA电泳的标准分子量（DNA Marker） 目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。
室减减态夫载凹拆滚狼枢挠钎育酷支防趾兢让郊匈腰惺刘望垛件伴几变托质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
毛初市薪负龄硼吗植篡畸泪财础炬甩叭巍嫡锅旷恼疙戚煎八剧卵伺压快胀质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
3.0
500bp~1kb
500bp~1kb
4.0
100bp~500bp
6.0
10bp～100bp
抑殷上共缴袄鹃洱弥晾明柞稠硫雇淤剃柯溯山线经堰滨俩桅无国砌享裁竹质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
2、DNA电泳影响因素 主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。 （1）DNA分子大小 DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大，泳动也越慢， 迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 （2）DNA分子构型 相同分子量质粒DNA，构型不同电泳时受的阻力不同，泳动速率不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状次之，开环最慢。
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实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型
凝胶 ——分离、鉴定、纯化DNA 影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构
象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成 缓冲液pH>DNA Pi，DNA带负电荷，迁移率与
分子量对数成反比 DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA>线
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注意观察溴酚蓝染液的迁移
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紫外灯下观察电泳结果
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状DNA>开环DNA
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不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
分离范围（kb） 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
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琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光
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主要实验器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
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电泳槽结构
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操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相8
准备胶槽
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凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml