琼脂糖凝胶电泳原理步骤详细
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤DNA的琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA 的大小和纯度，以及进行DNA分子的分离和纯化。
凝胶电泳实验可以帮助我们确定DNA样本的大小和获得纯化的DNA片段供进一步研究使用。
下面是DNA琼脂糖凝胶电泳实验的原理和操作步骤。
【原理】DNA琼脂糖凝胶电泳是根据DNA分子在电场中的不同迁移速率来分离大小不同的DNA片段。
琼脂糖凝胶是一种凝胶状物质，其孔隙大小能够将DNA分子限制在一定范围内，较大的DNA分子迁移速率较慢，而较小的DNA分子迁移速率较快。
琼脂糖凝胶通常是在平均浓度为1%至2%之间的范围内制备，以便在不同大小的DNA分子之间提供适当的分辨率。
实验中，DNA样品通过切割酶或PCR等方法获得，样品经过核酸电泳缓冲液稀释，并在琼脂糖凝胶板上进行电泳。
凝胶板两侧连接电源，DNA 的带电粒子将在电场的作用下从负极迁移到正极，迁移过程中形成DNA的“条带”，条带的位置和长度反映了DNA的大小。
通常，DNA条带由荧光染料或核酸染料标记，以便在电泳结束后进行可视化。
【操作步骤】以下是DNA琼脂糖凝胶电泳实验的一般操作步骤：1.制备琼脂糖凝胶板：a.准备琼脂糖粉末和核酸电泳缓冲液（通常为TAE或TBE缓冲液）。
b.按照说明书将琼脂糖粉末溶解于核酸电泳缓冲液中。
c.将溶液加热至沸腾并搅拌，使琼脂糖完全溶解。
d.将溶液倒入预先准备好的电泳仓中，插入梳子或制备好的孔板，使其凝固。
2.样品制备：a.提取DNA样品并测定其浓度。
b. 将DNA样品稀释到适当浓度，通常为10-50 ng/μL。
c. 添加适当的加载缓冲液，通常是一些染料和甘胺酸（glycine）或其他添加剂。
3.DNA加载和电泳：a.打开琼脂糖凝胶仓盖，将DNA样品负载于凝胶孔内。
b.将DNA负载区域和样品标注在电泳仓中，以便在电泳结束后可以准确识别DNA带。
c.关闭盖子，将电泳仓放入电泳设备中。
琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳原理简介琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和检测生物大分子的方法。
它基于琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电场作用使分子在凝胶中按照大小和形态的差异进行迁移，达到分离的目的。
该原理广泛应用于核酸和蛋白质的分离与分析领域。
原理琼脂糖凝胶电泳原理如下： 1. 凝胶制备：首先将琼脂糖与缓冲液混合并加热溶解，随后冷却形成凝胶。
凝胶的浓度可以根据需要调整，一般较低浓度的琼脂糖凝胶用于分离大分子，较高浓度的琼脂糖凝胶用于分离小分子。
2. 样品加载：将待分离的样品加入凝胶孔中。
琼脂糖凝胶是一种多孔的基质，具有类似于过滤器的功能。
样品中的分子会被凝胶网状结构所限制，在电场作用下沿凝胶中的微小通道向电极处迁移。
3. 电泳过程：连接正负极电源，通过电场使得带电分子根据大小和形态的差异在凝胶中迁移。
电泳时间的长短与迁移距离成正比，某些情况下可以通过控制电场强度或者时间来调节分离效果。
4. 可视化检测：根据需要，可以利用染色剂或标记物对凝胶中的分子进行可视化检测。
例如，核酸可以通过乙溴化氢染色可视化，蛋白质可以通过银染法或共价标记物进行检测。
琼脂糖凝胶电泳的原理主要涉及到两个方面：凝胶基质和电场迁移。
凝胶基质琼脂糖凝胶是一种由聚糖构成的多孔基质，其主要成分是琼脂糖和缓冲液。
琼脂糖是一种天然的含羟基多糖，具有较好的凝胶性质。
琼脂糖的浓度和凝胶构建方式可以根据需要来设计，以实现对待分离分子大小和分辨率的调控。
电场迁移琼脂糖凝胶电泳是利用电场作用使带电分子在凝胶中迁移。
电泳过程中，凝胶中的聚糖构成了一套通道网络，负载着电场的分布，变为一种微电泳介质。
带电分子受到电场力的影响，在凝胶中的通道中迁移。
根据分子的大小和形态的差异，迁移速率不同，从而实现分离效果。
较小的分子会迁移得更远，而较大的分子会受到较大的凝胶阻力，迁移距离较短。
应用琼脂糖凝胶电泳在生物学领域的应用非常广泛。
主要包括以下几个方面： - 核酸分离与分析：琼脂糖凝胶电泳可以用于核酸的分离与分析。
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法[实验原理]电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。
包含电解质的多孔支持介质----“胶”并把它置于静电场中。
则DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。
当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率。
因而就可依据DNA分子的大小来使其分离。
该过程通过把示踪染料（Purple Loading Dye）或分子量标准参照物(Ladder)和样品(DNA&RNA)一起进行电泳而得到检测。
分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。
[实验用品]1.琼脂糖 1.0%1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液(TAE),微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时可加入10mg/ml溴化乙锭10μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子(鉴定胶用细密点的梳子；回收胶用粗稀的梳子）的胶膜中在室温下放置30-45min后现进行电泳。
1.5%:琼脂糖1.5g。
2.电泳缓冲液50×TAE Tris 乙酸Tris 242g终2 mol/L乙酸57.1ml 终1mol/L0.5M EDTA200ml pH8.0终100mmol/L dH2O 补足至1000ml使用时稀释1×TAE。
5×TBE Tris 硼酸Tris 54g 终445mmol/L硼酸27.5g 终445mmol/L0.5M EDTA20ml pH8.0终10mmol/L dH2O 补足至1000ml使用时稀释10倍成0.5倍如50ml贮存液+450ml水→500ml工作液。
[实验内容与方法]1.移取适量的琼脂糖(如制备1%的琼脂糖胶液就移1g的琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液中)微波炉加热使其溶于TAE缓冲液中。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种凝胶电泳方法，用于生物化学、分子生物学、遗传学和临床化学，以分离琼脂糖基质中的大分子混合群，例如DNA、RNA 或蛋白质。
琼脂糖是从海藻中提取的天然线性聚合物，当在缓冲液中加热并冷却时，通过氢键形成凝胶基质。
它们是分离中、大型核酸最常用的介质，分离范围广。
琼脂糖凝胶电泳实验常用以DNA 切胶回收，DNA 分离和用于佐证DNA 是否重组、质粒等是否切开。
今天我们就来聊聊琼脂糖凝胶电泳实验的一些小技巧小细节。
第一步：胶液的制备称取0.4g 琼脂糖，置于200ml 锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热，直到琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。
总液体量不宜超过锥瓶的50%容量。
否则会溢出来的。
毛博就吃过这个亏。
还要擦洗微波炉。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
第二步：胶板的制备倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀。
东一块西一块的。
果冻做出来就不好看啦。
速度也不可太快，否则容易出现气泡。
果冻做出来里面都是气泡。
怎么吃呀？待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。
第三步：加样注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
果冻下面被戳个窟窿，还怎么吃呀？第四步：电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。
第五步：染色未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室温下染色20-25 分钟。
第六步：观察和拍照在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。
DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
除这些细节之外，还有一些注意事项：1. 酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。
简述琼脂糖凝胶电泳的基本过程
简述琼脂糖凝胶电泳的基本过程
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的生物分子分离和分析技术。
其基本过程如下：
1. 制备琼脂糖凝胶：将琼脂糖粉溶解在缓冲液中，加热并搅拌使其溶解，然后待其冷却凝胶化。
凝胶化的时间和温度可以根据需要来调节，一般凝胶化时间为30-60分钟。
2. 电泳槽的装置：凝胶凝胶化后，将其放入电泳槽中，槽中注入足够的缓冲液，使凝胶完全浸泡其中，确保电泳过程中缓冲液的循环。
3. 样品制备：将要分析的待分离生物分子样品进行处理，通常会进行核酸或蛋白质的提取、纯化和浓缩等步骤，得到待分析的样品。
4. 样品加载：在经过处理的样品中加入适量的载体，使样品具有一定的密度，然后将样品加载到凝胶孔中。
通常在一个凝胶中加载多个样品以实现多项分离。
5. 电泳：将电泳槽连接到电源上，通常使用直流电。
电场的作用下，待分离的生物分子带上电荷，沿着电场方向迁移，根据它们的大小和形状的不同，迁移速率也会有所不同。
较小的分子会迁移得更快，而较大的分子则迁移速度较慢。
6. 分析结果：电泳进行一段时间后，关闭电源，取出凝胶进行染色或其他相关检测分析。
染色后，在紫外线照射下可以观察
到凝胶上待分离生物分子的条带，根据条带的位置和大小可以进行分析和定量。
琼脂糖凝胶电泳具有操作简单、分辨效果好等优点，广泛应用于核酸和蛋白质的分离、纯化和分析等领域。
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程一、实验目得:琼脂糖凝胶电泳就是常用得检测核酸得方法,具有操作方便、经济快速等优点。
DNA琼脂糖凝胶电泳得使用技术仅代表具备操作琼脂糖电泳得能力。
二、实验原理:琼脂糖凝胶电泳就是常用得用于分离、鉴定DNＡ、ＲＮA分子混合物得方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时得电荷效应与分子筛效应,达到分离混合物得目得。
DＮＡ分子在高于其等电点得溶液中带负电,在电场中向阳极移动。
在一定得电场强度下,DNA分子得迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身得大小与构型就是主要得影响因素。
DＮA分子得迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型得ＤＮＡ分子得迁移速度不同。
如环形ＤNA 分子样品,其中有三种构型得分子:共价闭合环状得超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDＮA)、与线形DＮA分子(IDNA)。
这三种不同构型分子进行电泳时得迁移速度大小顺序为:cccDNA〉ＩDN Ａ>ocＤNA、影响核酸分子泳动率得因素主要还就是:1、DＮＡ分子大小;2、琼脂糖浓度;３、DＮＡ构想;4、所用得电压;５、琼脂糖种类;6、电泳缓冲液。
核酸电泳中常用得染色剂就是溴化乙锭(ethidｉum bromiｄe EB)。
溴化乙锭就是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链得配对碱基之间、在紫外线照射ＢＥ-DNA复合物时,出现不同得效应、2５4ｎm得紫外线照射时,灵敏度最高,但对ＤNA损伤严重;360ｎm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对ＤNＡ损伤小,所以适合对ＤＮA样品得观察与回收等操作。
3００nm紫外线照射得灵敏度较高,且对ＤNA损伤不就是很大,所以也比较适用。
三、材料、试剂及器具1、材料:不同大小得基因组片段2、试剂:Hｉnd III diｇｅｓｔDNA Marker(分子量标准)(TaKaRa);D2000(TianGeｎ);琼脂糖;加样缓冲液(6x):溴酚蓝;电泳缓冲液(1×TAE);溴化乙锭(EB);3、仪器及器具:(1)移液器、吸头、锥形瓶(2)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。
DNA琼脂糖凝胶电泳原理
DNA琼脂糖凝胶电泳原理DNA琼脂糖凝胶电泳利用琼脂糖作为基质，形成一种网状结构的凝胶。
琼脂糖凝胶由琼脂糖粉溶于缓冲液中，并在高温下混合，形成一种凝胶液。
凝胶液在室温下冷却，变成凝胶。
DNA分子可以通过凝胶中的孔隙移动，该移动速度取决于DNA分子的大小。
步骤1：制备琼脂糖凝胶a.准备琼脂糖溶液：按照实验要求，加水将琼脂糖粉溶解。
b.加入缓冲液：将缓冲液加入琼脂糖溶液中，混合均匀。
c.煮沸琼脂糖溶液：将混合好的溶液放入显影槽，使用微波炉或煮沸水浴，使其煮沸几分钟，直到完全溶解。
d.冷却凝固：将煮沸后的溶液静置至室温，等待凝胶冷却凝固。
步骤2：样品处理a.增强样品蛋白酶降解：将待分析的DNA样品加入增强样品液中，在适当的温度下进行酶解反应，以去除样品中的蛋白质。
b.加载缓冲液：将待处理的DNA样品与加载缓冲液混合，以改变DNA样品的密度，使其易于加载到凝胶槽中。
步骤3：电泳分离a.加载样品：使用微量吸管，将样品小心地加载到凝胶槽中的样品孔中。
b.开始电泳：将电泳槽连接到电源，并使用适当的电压（通常为100-200V）进行电泳分离。
c.时间控制：视实验需要，可以根据时间控制电泳进行特定的DNA片段分离。
通常，较短的DNA片段会迁移得更快。
d.显影染色：电泳完成后，将凝胶从槽中取出，用染色剂处理。
不同的染料可用于可见或荧光检测。
步骤4：结果分析a.观察凝胶：将处理后的凝胶在紫外线照射下照明，可以看到DNA分子在凝胶中的迁移情况。
不同大小的DNA片段将形成明显的条带。
b.分析条带：通过比较样品条带与已知DNA分子大小的条带，可以确定样品中的DNA片段大小。
c.数据解读：根据DNA片段的大小和浓度，可绘制电泳分离图谱，进一步分析样品中的DNA分子。
总结：DNA琼脂糖凝胶电泳是一种基于DNA分子在凝胶中电荷移动的技术。
它可用于分离和分析DNA样品中不同大小的DNA分子。
经过凝胶电泳分离和染色后，可以通过观察条带和数据分析，对样品中的DNA分子进行进一步研究。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理与方法 PPT
六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
按电泳法分:
按超速离心法分:
乳糜微粒(CM)
乳糜微粒CM ( < 0、96 )
-脂蛋白 (-位) 极低密度脂蛋白VLDL(0、961、006)
前-脂蛋白(2-位) 低密度脂蛋白LDL (1、0191、063) -脂蛋白 (1-位) 高密度脂蛋白HDL(1、0631、21)
进行印迹转移电泳时,要注意缓冲液得离子强度要低,pH要远 离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好得Tris-缓冲体 系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或 电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过 高。
五、交变脉冲电场凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb得DNA。 这就是因为在琼脂糖凝胶中,DNA分子得有效直径超 过凝胶孔径时,在电场作用下,迫使DNA变形挤过筛孔, 而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不 大。如此时改变电场方向,则DNA分子必须改变其构 象,沿新得泳动方向伸直,而转向时间与DNA分子大小 关系极为密切。
D-半乳糖
3,6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖链依分子内与分子间氢键及其它力得作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝 胶。
冷却
松散,随机地,盘绕地琼脂糖链
双螺旋结构区域与线性链相链接
淬火
溶胶状态
初级胶
最终得凝胶结构
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下: (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事
按支持物得装置形式不同,区带电泳可为: ➢平板式电泳,支持物水平放置,就是最常用得 电泳方式; ➢垂直板式电泳,聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直 板式电泳; ➢垂直柱式电泳,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即 属于此类; ➢连续液动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸垂 直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向下流, 与电泳方向垂直。
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（二）分类 1. 按电泳法分
乳糜微粒（chylomicron,CM） -脂蛋白 （ - lipoprotein） 前-脂蛋白（pre - lipoprotein ） -脂蛋白 （ - lipoprotein ）
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Percent agarose and resolution limits
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讲课内容
1
概述
2
琼脂糖凝胶的特点
3
琼脂糖凝胶电泳的应用
4
影响迁移率的因素
5
琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白
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琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白
❖原理（ Principle） 血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂
❖ 特点（characteristic）： 1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔
中泳动 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定
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琼脂糖凝胶（Agarose Gel ）
天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从 石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高 聚物。 琼脂糖（agarose） 琼脂果胶（agaropectin）
Acid sulfate Carboxylic acid groups
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D-半乳糖
3，6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖（Agarose） 半乳糖及其衍生物构成的中性物质
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讲课内容
1
概述
2
琼脂糖凝胶的特点
3
琼脂糖凝胶电泳的应用
4
影响迁移率的因素
5
琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白
概述
2
琼脂糖凝胶的特点
3
琼脂糖凝胶电泳的应用
4
影响迁移率的因素
5
琼脂糖凝பைடு நூலகம்电泳分离血浆脂蛋白
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琼脂糖凝胶电泳的应用 Applications of Agarose Gel Electrophoresis
1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定 及纯化
2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分 离与检测
糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中 电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离 成不同区带。
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(一)血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB
protein：Apoprotein ApoC ApoD ApoE
脂类 少量糖
甘油三酯 （TG） 磷脂 （PL）
2. 按超速离心法分
乳糜微粒(chylomicron,CM) ( < 0.94 ) 极低密度脂蛋白 (0.941.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.0061.019) (intermediate density lipoprotein, IDL) 低密度脂蛋白LDL(1.0191.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.0631.21) (high density lipoprotein, HDL)
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讲课内容
1
概述
2
琼脂糖凝胶的特点
3
琼脂糖凝胶电泳的应用
4
影响迁移率的因素
5
琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白
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影响迁移率的因素 Factors affecting migration
❖the size of the molecule ❖conformation of the molecule ❖the agarose concentration of a gel ❖ Voltage
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琼脂糖凝胶的特点
（一）优点（advantage)
1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、
病毒 等大分子物质 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性
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（三）结 构 特 征
CM
甘油三脂
多
胆固醇
多
蛋白质
少
带电量（Q）pH8.6为例
少
颗粒大小（mm）
大
密度
低
电泳速度
慢
形态
VLDL 规则
LDL 不规则
HDL
少 少 多 多 小 高 快
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❖ pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时 由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL 形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前
3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生 化指标
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The gel with UV illumination, the ethidium bromide stained DNA glows orange
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Digital image of 3 plasmid restriction digests run on a 1% w/v agarose gel, 3 Volts/cm, stained with ethidium bromide. The DNA size marker is a commercial 1 kbp ladder. The position of the wells and direction of DNA migration is noted.
琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis
李莉
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讲课内容
1
概述
2
琼脂糖凝胶的特点
3
琼脂糖凝胶电泳的应用
4
影响迁移率的因素
5
琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白
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概述 Introduction
❖Gel Electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉 胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。
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（二）缺点(disadvantage) 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立
即固定染色 4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，
区带少
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讲课内容
1