实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
实验五 DNA的限制性酶切和电泳
实验五 DNA的限制性酶切和电泳实验五dna的限制性酶切和电泳实验五dna的限制性酶切和琼脂糖电泳一、实验目的掌握dna的限制性酶切的基本原理和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术二、实验原理1、dna的限制性酶乌限制性内切酶是基因操作中不可缺少的工具酶，它能够识别双链dna的特定位点并切开dna，这个特定位点是一段具有旋转对称结构的dna片段。
绝大多数的管制酶辨识长度为4~8个核苷酸且呈圆形二重等距的如上所述序列。
ecori的辨识序列就是g↓aattc，bmhi的辨识序列就是g↓gatcc，hindiii的辨识序列就是a↓agctt。
每种限制性内切酶都有特定的反应条件，如特定的ph范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。
一般温度37℃，ph7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有tris、nacl、mgcl2，和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。
典型的反应体系中包含lμg或更太少的dna和1单位酶以及最合适的反应介质。
反应总体积通常掌控在20和50μ之间，反应时间在1小时，而反应的中止则由edta溶液的重新加入顺利完成，因为它能够鳌再分核酸酶活性所所需的金属离子。
2、dna的琼脂糖电泳dna的电泳存有琼脂糖电泳和共聚丙烯酰胺电泳，它们就是拆分、鉴别和提纯dna片段的标准方法。
dna的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。
在ph值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。
琼脂糖凝胶对dna的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的dna。
而分离小片段dna（5~500bp）则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其分辨力极高，能分离相差1bp的片段。
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分子量分析方法。
在琼脂糖
凝胶电泳中，核酸样品首先被混合到琼脂糖凝胶中，然后通过电场
进行分离。
琼脂糖凝胶的孔隙大小会影响核酸分子的迁移速度，从
而实现分子量的分离。
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量的过程中，我们需要考虑一些
因素。
首先是琼脂糖的浓度，不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离不同
范围大小的核酸分子。
其次是电场的强度和时间，这些参数会影响
核酸分子的迁移速度和分离效果。
另外，还需要考虑使用何种缓冲
液来维持电泳过程的稳定性。
在实际操作中，我们通常会使用DNA或RNA分子量标准品作为
参照物，通过与标准品的比较来确定待测核酸分子的分子量。
此外，琼脂糖凝胶电泳也可以结合染色剂如乙溴化蒽酮（Ethidium Bromide）来观察核酸分子的迁移情况，从而进一步分析核酸的分子量。
总的来说，琼脂糖凝胶电泳是一种简单而有效的核酸分子量分
析方法，通过合理设置实验条件和对照标准品，可以准确地分离和
测定核酸分子的分子量。
这种方法在生物学和分子生物学领域被广泛应用，为研究人员提供了重要的实验数据。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验⼀、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA ⽚段的常⽤技术。
把DNA样品加⼊到⼀块包含电解质的多孔⽀持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分⼦的双螺旋⾻架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应。
具有不同的相对分⼦质量的DNA⽚段泳动速度不⼀样，因⽽可依据DNA分⼦的⼤⼩来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分⼦质量的DNA，也可以分离相对分⼦质量相同，⽽构型不同的DNA分⼦。
在电泳过程中可以通过⽰踪染料或相对分⼦质量标准参照物和样品⼀起进⾏电泳⽽得到检测。
相对分⼦质量标准参照物相对可以提供⼀个⽤于确定DNA⽚段⼤⼩的标准。
在凝胶中加⼊少量溴化⼄锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分⼦可插⼊DNA的碱基之间，形成⼀种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红⾊荧光，因此也可对分离的DNA进⾏检测。
⼀般琼脂糖凝胶电泳适⽤于⼤⼩在0.2kb～50kb范围内的DNA⽚段。
三种不同构型分⼦进⾏电泳时的迁移速度⼤⼩顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的⽤来进⾏⼤⽚段核酸的电泳，⾼浓度的⽤来进⾏⼩⽚段分析。
低浓度胶易碎，⼩⼼操作和使⽤质量好的琼脂糖是解决办法。
注意⾼浓度的胶可能使分⼦⼤⼩相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常⽤的缓冲液有TAE和TBE，⽽TBE⽐TAE有着更好的缓冲能⼒。
电泳时使⽤新制的缓冲液可以明显提⾼电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使⽤后，离⼦强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产⽣条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳⼀定要使⽤DNA Marker或已知⼤⼩的正对照DNA来估计DNA⽚段⼤⼩。
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告一、实验目的本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，对DNA分子进行分离和检测，掌握琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解其在生物学领域中的应用。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离DNA分子的方法。
其原理是利用电场作用力将DNA分子从样品中移动到凝胶中，并根据DNA分子大小不同，在凝胶中形成不同迁移距离的带状图案。
根据带状图案可以得到DNA片段大小及其相对含量。
三、实验步骤1.制备琼脂糖凝胶：将1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中，加热搅拌至溶解，冷却至60℃左右时倒入模具中，待冷却成固体后取出。
2.制备DNA样品：将待检测DNA样品加入适量TAE缓冲液中，使其浓度为50ng/ul。
3.装载样品：取出制备好的琼脂糖凝胶，将其置于电泳槽中，加入适量TAE缓冲液，然后将DNA样品注入琼脂糖凝胶孔中。
4.进行电泳：将电泳槽盖好，接通电源，设定电压和时间，进行电泳。
5.染色和成像：取出琼脂糖凝胶，进行染色处理，然后用成像仪拍摄带状图案。
四、实验结果通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，成功分离出待检测DNA样品中的DNA分子，并形成了带状图案。
根据带状图案可以看出不同大小的DNA片段在凝胶中形成了不同迁移距离的带状图案。
五、实验分析1.影响DNA迁移距离的因素：DNA片段大小、琼脂糖浓度、电场强度等因素都会影响DNA分子在凝胶中的迁移距离。
一般来说，较小的DNA片段在相同条件下迁移距离较大。
2.应用领域：琼脂糖凝胶电泳技术广泛应用于生物学领域中对DNA分子的检测和分析。
例如，可以用于分析DNA序列、检测基因突变等。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解了其在生物学领域中的应用。
同时，我们也发现琼脂糖凝胶电泳技术具有操作简单、成本低廉、结果可靠等优点，是一种常用的DNA分子检测方法。
最新实验五植物基因组DNA提取知识讲解
注意事项
1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提 液充分混匀；
2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添 加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料；
3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再 溶解难；
4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采 用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同 时还要避免核酸降解酶类的降解。
核酸的理化性质
DNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品 呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于 水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比 游离酸易溶于水。
在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液 中较稳定。
操作步骤 细胞破碎
抽提去蛋白质 沉淀核酸
3. 12000r/min 离心 5min，取上清液700μL转到另一离心管 中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒 混匀。12000r/min，离心 5min。抽提去蛋白
4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 600µL异丙醇。颠 倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸
5．12000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干 燥。 将沉淀回溶于20µL TE 缓冲液待测。
作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。
核酸染色剂
溴化乙锭（EB）
是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在 紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正 比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng。
05 实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(λ DNA,Hind III)(考核15%)
理和适用范围有什么异同？
如果用EcoR
I酶解λ DNA，电泳后的胶
图会如何？
解释限制性核酸内切酶专一性的机理。
器材
电泳仪（DYY-2C），水平电泳槽 微量加液器（10 uL），枪头（10 离心管0.5 mL，离心管架 恒温水浴
uL）
凝胶成像仪（Gel Logic
Gold
淹没胶孔。
制样
1号样：2 uL λ DNA + 18 uL 蒸馏水 + 5 uL 加样缓冲液，混匀，取10 uL点样。 2号样：20 uL λ DNA酶切液 + 5 uL加样
缓冲液，混匀，取10 uL点样。
点样
吸取10
uL样液；
将枪头贴近样孔上沿，略微插入样孔；
（注意：枪头不要戳破胶孔底部）
212 PRO）
view溶液
10×Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，
100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇， 500 mmol/L NaCl ）
试 剂
5×TBE缓冲液：Tris[111] 54
g，硼酸
[61.83] 27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA
0.5×TBE电泳缓冲液：用5×TBE液稀释 Gold
View：每100 mL琼脂糖胶加5 uL
试 剂
加样缓冲液（5×）（Loading dye）
溴酚蓝 （300 bp） 二甲苯腈蓝 （4000 bp） 蔗糖（甘油） Tris-HCl
思考题
加样缓冲液中各个组分的作用是什么？ 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原
轻轻将样液一次连续注入样孔。
质粒的提取及凝胶糖凝胶电泳鉴定
实 验 步 骤
50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2
200 mM NaOH 1% （W/V） SDS
2
5 min
3 M NaAC
省去Leabharlann 30 min 以上四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理
不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电 泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。
8.12000rpm，4℃，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。
9.加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4℃，离心10min。 10.弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒 DNA制品。 11.将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入1u 或20ug/ml RNaseA）待用。
细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是 分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达 的好材料。
二、实验原理
碱变性抽提法法是常用的方法之一. 此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达
到分离的目的。
在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺 旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺 旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用 pH4.8 的 Kac 高 盐 缓 冲 液 调 节 pH 至 中 性 时 ， 变 性 的 质 粒 DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中， 而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳 定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
2.凝胶板的制作： 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两 端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的 模板置于水平台上，迅速将上面 胶液倒在模板的中央，让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固，将胶纸围墙慢慢取下，制备 好的凝胶板放入电泳槽中，加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深， 取出样品梳。
琼脂糖凝胶电泳 实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告琼脂糖凝胶电泳实验报告引言：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的方法。
它基于琼脂糖凝胶的孔隙大小，通过电场作用下分离样品中的不同分子。
本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳技术，分离并分析DNA样品中的不同片段。
实验材料与方法：1. 实验材料：-琼脂糖凝胶：用于制备凝胶基质，提供分离分子的孔隙。
-缓冲液：用于维持凝胶的pH值和离子浓度稳定。
-DNA样品：包含待分离的DNA片段，可通过PCR扩增获得。
2. 实验步骤：（1）制备琼脂糖凝胶：将适量琼脂糖加入缓冲液中，加热搅拌至溶解，待冷却至大约60℃时，倒入凝胶模具中，插入梳子，待凝胶完全固化后，取出梳子。
（2）样品处理：将待分离的DNA样品与DNA加载缓冲液混合，加热至95℃，使DNA变性，然后迅速冷却至室温。
（3）电泳分离：将凝胶模具放入电泳槽中，加入足够的缓冲液，将DNA样品加入凝胶孔中，连接电源，施加适当电压，进行电泳分离。
结果与讨论：经过电泳分离后，我们观察到琼脂糖凝胶上出现了一系列DNA条带。
这些条带的迁移距离与DNA片段的大小成反比，即较小的片段迁移距离较远，较大的片段迁移距离较短。
实验结果的解释可以通过琼脂糖凝胶电泳的原理来理解。
琼脂糖凝胶的孔隙大小决定了不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速度。
较小的DNA片段能够更容易通过凝胶孔隙，因此迁移距离较远；而较大的DNA片段则受到凝胶孔隙的限制，迁移距离较短。
通过对DNA条带的大小和形状进行分析，我们可以获得关于DNA样品的重要信息。
例如，我们可以确定样品中是否存在特定的DNA片段，或者在PCR扩增中是否成功地放大了目标片段。
总结：琼脂糖凝胶电泳是一种简单而有效的生物大分子分离和分析方法。
通过电泳分离DNA样品，我们可以快速获得关于样品中DNA片段的信息。
这种技术在分子生物学、遗传学等领域有着广泛的应用，对于研究和诊断基因相关的疾病具有重要意义。
在今后的研究中，我们可以进一步探索琼脂糖凝胶电泳的应用，并结合其他分析技术，提高实验的准确性和灵敏度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验五核酸琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。
此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。
ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
三、材料、仪器和试剂
1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA
2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统
3、试剂
（1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。
（2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。
（3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。
用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。
（4）分子量标准DNA：DNA Marker
四、操作步骤
1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml)：称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的
2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。
将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。
在冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料（10ml:1ul），混匀后小
心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。
加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。
微波炉中加热时间不宜过长。
倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
3、加样：在点样板或EP管中混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。
用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染。
加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记下加样的顺序)。
注意：加样时，要把枪头插入到加样孔里，但是不要插穿加样孔底部凝胶，保证样品尽量在加样孔中而不外溢。
4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5、电泳完毕后，取出凝胶
6、观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
注意事项：
1、操作时带一次性手套，避免DNA酶污染引起DNA降解。
2、及时更换电泳缓冲液，电泳缓冲液在电泳槽中存放过，多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
3、一般情况，电泳电压<20V/cm，温度<30℃；大分子量DNA链电泳，温度应<15℃。
4、电泳前样品勿受热，以免引起DNA变性。
5、凝胶中DNA的上量要合适，太多会引起DNA条带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA条带。
思考题
1、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
2、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？。