实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分子量分析方法。
在琼脂糖
凝胶电泳中，核酸样品首先被混合到琼脂糖凝胶中，然后通过电场
进行分离。
琼脂糖凝胶的孔隙大小会影响核酸分子的迁移速度，从
而实现分子量的分离。
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量的过程中，我们需要考虑一些
因素。
首先是琼脂糖的浓度，不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离不同
范围大小的核酸分子。
其次是电场的强度和时间，这些参数会影响
核酸分子的迁移速度和分离效果。
另外，还需要考虑使用何种缓冲
液来维持电泳过程的稳定性。
在实际操作中，我们通常会使用DNA或RNA分子量标准品作为
参照物，通过与标准品的比较来确定待测核酸分子的分子量。
此外，琼脂糖凝胶电泳也可以结合染色剂如乙溴化蒽酮（Ethidium Bromide）来观察核酸分子的迁移情况，从而进一步分析核酸的分子量。
总的来说，琼脂糖凝胶电泳是一种简单而有效的核酸分子量分
析方法，通过合理设置实验条件和对照标准品，可以准确地分离和
测定核酸分子的分子量。
这种方法在生物学和分子生物学领域被广泛应用，为研究人员提供了重要的实验数据。
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。
注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验⼀、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA ⽚段的常⽤技术。
把DNA样品加⼊到⼀块包含电解质的多孔⽀持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分⼦的双螺旋⾻架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应。
具有不同的相对分⼦质量的DNA⽚段泳动速度不⼀样，因⽽可依据DNA分⼦的⼤⼩来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分⼦质量的DNA，也可以分离相对分⼦质量相同，⽽构型不同的DNA分⼦。
在电泳过程中可以通过⽰踪染料或相对分⼦质量标准参照物和样品⼀起进⾏电泳⽽得到检测。
相对分⼦质量标准参照物相对可以提供⼀个⽤于确定DNA⽚段⼤⼩的标准。
在凝胶中加⼊少量溴化⼄锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分⼦可插⼊DNA的碱基之间，形成⼀种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红⾊荧光，因此也可对分离的DNA进⾏检测。
⼀般琼脂糖凝胶电泳适⽤于⼤⼩在0.2kb～50kb范围内的DNA⽚段。
三种不同构型分⼦进⾏电泳时的迁移速度⼤⼩顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的⽤来进⾏⼤⽚段核酸的电泳，⾼浓度的⽤来进⾏⼩⽚段分析。
低浓度胶易碎，⼩⼼操作和使⽤质量好的琼脂糖是解决办法。
注意⾼浓度的胶可能使分⼦⼤⼩相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常⽤的缓冲液有TAE和TBE，⽽TBE⽐TAE有着更好的缓冲能⼒。
电泳时使⽤新制的缓冲液可以明显提⾼电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使⽤后，离⼦强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产⽣条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳⼀定要使⽤DNA Marker或已知⼤⼩的正对照DNA来估计DNA⽚段⼤⼩。
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告一、实验目的本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，对DNA分子进行分离和检测，掌握琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解其在生物学领域中的应用。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离DNA分子的方法。
其原理是利用电场作用力将DNA分子从样品中移动到凝胶中，并根据DNA分子大小不同，在凝胶中形成不同迁移距离的带状图案。
根据带状图案可以得到DNA片段大小及其相对含量。
三、实验步骤1.制备琼脂糖凝胶：将1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中，加热搅拌至溶解，冷却至60℃左右时倒入模具中，待冷却成固体后取出。
2.制备DNA样品：将待检测DNA样品加入适量TAE缓冲液中，使其浓度为50ng/ul。
3.装载样品：取出制备好的琼脂糖凝胶，将其置于电泳槽中，加入适量TAE缓冲液，然后将DNA样品注入琼脂糖凝胶孔中。
4.进行电泳：将电泳槽盖好，接通电源，设定电压和时间，进行电泳。
5.染色和成像：取出琼脂糖凝胶，进行染色处理，然后用成像仪拍摄带状图案。
四、实验结果通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，成功分离出待检测DNA样品中的DNA分子，并形成了带状图案。
根据带状图案可以看出不同大小的DNA片段在凝胶中形成了不同迁移距离的带状图案。
五、实验分析1.影响DNA迁移距离的因素：DNA片段大小、琼脂糖浓度、电场强度等因素都会影响DNA分子在凝胶中的迁移距离。
一般来说，较小的DNA片段在相同条件下迁移距离较大。
2.应用领域：琼脂糖凝胶电泳技术广泛应用于生物学领域中对DNA分子的检测和分析。
例如，可以用于分析DNA序列、检测基因突变等。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解了其在生物学领域中的应用。
同时，我们也发现琼脂糖凝胶电泳技术具有操作简单、成本低廉、结果可靠等优点，是一种常用的DNA分子检测方法。
05 实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(λ DNA,Hind III)(考核15%)
理和适用范围有什么异同？
如果用EcoR
I酶解λ DNA，电泳后的胶
图会如何？
解释限制性核酸内切酶专一性的机理。
器材
电泳仪（DYY-2C），水平电泳槽 微量加液器（10 uL），枪头（10 离心管0.5 mL，离心管架 恒温水浴
uL）
凝胶成像仪（Gel Logic
Gold
淹没胶孔。
制样
1号样：2 uL λ DNA + 18 uL 蒸馏水 + 5 uL 加样缓冲液，混匀，取10 uL点样。 2号样：20 uL λ DNA酶切液 + 5 uL加样
缓冲液，混匀，取10 uL点样。
点样
吸取10
uL样液；
将枪头贴近样孔上沿，略微插入样孔；
（注意：枪头不要戳破胶孔底部）
212 PRO）
view溶液
10×Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，
100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇， 500 mmol/L NaCl ）
试 剂
5×TBE缓冲液：Tris[111] 54
g，硼酸
[61.83] 27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA
0.5×TBE电泳缓冲液：用5×TBE液稀释 Gold
View：每100 mL琼脂糖胶加5 uL
试 剂
加样缓冲液（5×）（Loading dye）
溴酚蓝 （300 bp） 二甲苯腈蓝 （4000 bp） 蔗糖（甘油） Tris-HCl
思考题
加样缓冲液中各个组分的作用是什么？ 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原
轻轻将样液一次连续注入样孔。
质粒的提取及凝胶糖凝胶电泳鉴定
实 验 步 骤
50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2
200 mM NaOH 1% （W/V） SDS
2
5 min
3 M NaAC
省去Leabharlann 30 min 以上四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理
不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电 泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。
8.12000rpm，4℃，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。
9.加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4℃，离心10min。 10.弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒 DNA制品。 11.将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入1u 或20ug/ml RNaseA）待用。
细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是 分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达 的好材料。
二、实验原理
碱变性抽提法法是常用的方法之一. 此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达
到分离的目的。
在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺 旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺 旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用 pH4.8 的 Kac 高 盐 缓 冲 液 调 节 pH 至 中 性 时 ， 变 性 的 质 粒 DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中， 而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳 定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
2.凝胶板的制作： 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两 端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的 模板置于水平台上，迅速将上面 胶液倒在模板的中央，让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固，将胶纸围墙慢慢取下，制备 好的凝胶板放入电泳槽中，加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深， 取出样品梳。
琼脂糖凝胶电泳整个详细操作流程
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生化实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳
加样缓冲液
0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp) 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp） 40%蔗糖
EB（溴化乙锭）染色液（有毒）
0.5ug /ml，用水配制
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)
每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：7.5~8.0
缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷） NaCl、MgCl2、 巯基乙醇
温度：37℃
琼脂糖凝胶电泳
是一种简便、快速的分离纯化 和鉴定核酸的方法。
琼脂糖是一种线性多糖聚合 物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷 却凝固,会形成良好的电泳介质。
是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸 的碱基对之间，在紫外线激发下，发出 桔红色荧光。
电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB 溶液中染色10min。在紫外光照射下可见 核酸电泳带，DNA量一般>5ng。
操作步骤
酶切反应
反应体系
λ－DNA 10 x Buffer Hind III H2O
电泳
在电场的作用下，在某种支持介 质上，将一个混合物分离成若干条 区
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分离范围(Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
试剂
TBE电泳缓冲液
Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3λ-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4λ-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye
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实验五核酸琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学
习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的
一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA在碱性条件下（pH8.0 的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和
构型不同，在电场中的泳动速率也不同。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。
此核酸染料在紫
外透照仪及可见光透射仪上均可使用。
ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
［琼脂糖凝胶浓度与线n：DN A分离范围参数
■ 凝胶浓度（%）线性DZAK度（bp）
■■0.5
0.7
1000^
800-
—30000
-12000
■ 1.0500宀-10000■ 1.2400^^7000■ 1.5200^-3000■ 2.050〜2000
三、材料、仪器和试剂
1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA
2 、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝
胶成像系统
3、试剂
(1)50 X TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g , EDTA 37.2g ,加入约800ml的去离子水，
充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L ,室温保存。
(2) 6 X电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40% ( W/V )蔗糖水溶液，贮存于4 C。
(3)溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/mL 。
用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。
( 4)分子量标准DNA ：DNA Marker
四、操作步骤
1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml):称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1X TAE ，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0% 琼脂糖凝胶液。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的
2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。
将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。
在冷却到65 C左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料(10ml:1ul ),混匀后小
心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1 x TAE 电泳缓冲液至没过胶板1-2伽为止。
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。
加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。
微波炉中加热时间不宜过长。
倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高（＞60 C ），会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子
浓度，影响电泳效果。
3、加样：在点样板或EP管中混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。
用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，
应更换一个加样头，以防污染。
加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记
下加样的顺序）。
注意：加样时，要把枪头插入到加样孔里，但是不要插穿加样孔底部凝胶，保证样品尽
量在加样孔中而不外溢。
4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V ，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下
沿约1cm 处时，停止电泳。
5、电泳完毕后，取出凝胶
6、观察照相：在紫外灯下观察，DNA 存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
注意事项：
1、操作时带一次性手套，避免DNA 酶污染引起DNA 降解。
2、及时更换电泳缓冲液，电泳缓冲液在电泳槽中存放过，多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
3、一般情况，电泳电压＜20V/cm ,温度＜30 C；大分子量DNA链电泳，温度应＜15 C。
4、电泳前样品勿受热，以免引起DNA 变性。
5、凝胶中DNA 的上量要合适，太多会引起DNA 条带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA 条带。
思考题
1 、琼脂糖凝胶电泳中DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？
2、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？。