临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第八章 荧光免疫技术讲义
第八章荧光免疫技术第一节概述一、荧光的基本知识1、荧光荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。
2、发射光谱发射光谱是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度。
激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。
3、激发光谱激发光谱是指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。
4、荧光效率荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。
在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。
荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）/吸收光的光量子数（激发光强度）。
5、荧光寿命荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。
激发光消失，荧光现象随之消失，但各种荧光物质的荧光寿命不同，可利用延时测定的方法消除某些短寿命荧光的干扰，此为时间分辨荧光免疫测定的理论基础。
6、荧光淬灭荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、Ⅰ-、硝基苯等）作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。
7、荧光偏振P=F H-F L／F H+F L式中：P表示偏振度,F H表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度，F L是上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度。
当P=0时，说明完全不偏振；P在-1～+1之间即为部分偏振。
二、荧光物质（一）荧光色素能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物称为免疫荧光色素或荧光染料。
1、异硫氰酸荧光素（FITC）黄绿色荧光为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。
分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。
2、四乙基罗丹明（RB200）橘红色荧光为橘红色粉末，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
性质稳定，可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）橙红色荧光最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。
与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
4、藻红蛋白（R-RE）橙色荧光本品为无定形，褐红色粉末，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。
最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。
与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。
（二）其他荧光物质1、镧系螯合物其中以Eu3＋应用最广。
Eu3＋螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。
2、酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。
第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。
（一）抗体要求将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。
用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。
（二）荧光素要求实验室最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素。
作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除；②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
（三）抗体的荧光素标记1、搅拌法此法适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。
优点是标记时间短，荧光素用量少。
但本法的影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。
2、透析法适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。
此法标记比较均匀，非特异染色也较低。
方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含FITC的0.01mol／L pH 9.4的碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对PBS透析法去除游离色素。
低速离心，取上清液。
（四）荧光素标记抗体的纯化1、透析法2、层析法（五）荧光素标记抗体的鉴定1、荧光素与蛋白质的结合比率结合的荧光抗体，并不是均一的，有的过量结合，有的未结合。
过量结合者是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用。
2、抗体效价荧光抗体制备完成后应对其活性加以鉴定。
可以采用双向免疫扩散试验测定抗体效价，抗原含量为1g ／L时，抗体效价＞1：16者较为理想。
3、抗体特异性①吸收试验：向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后，再用于阳性标本染色，应不出现明显荧光。
②抑制试验：阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色，应受到明显抑制。
（六）荧光抗体的保存荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光淬灭。
最好小量分装，－20℃冻存可保存2～3年。
真空干燥后可长期保存。
稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。
二、标本的制作常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。
三、荧光抗体染色与结果判断（一）直接法特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。
（二）间接法可用于检测抗原和抗体。
本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。
（三）双标记法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。
在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。
（四）荧光抗体染色结果判断四、荧光显微镜的基本结构（一）光源通常用高压汞灯、氛灯或卤素灯作为激发光源。
（二）滤光片滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。
（三）光路（四）聚光器（五）镜头第三节荧光免疫分析的类型荧光免疫技术包括了荧光抗体技术和荧光免疫测定分析技术。
荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。
一、时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非放射性核素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）基本原理1、时间分辨2、Stokes位移激发光谱和发射光谱的波长差。
镧系元素的荧光光谱Stokes位移较大，为273nm，很容易利用简单的滤光片进行波长分辨，把激发光和发射光分开，消除激发光的散射（由样品池、溶剂分子和溶液中胶体颗粒引起）干扰。
3、发射光谱和激发光谱镧系元素发射光谱带较窄，有效地降低了本底荧光。
镧系元素激发光谱带较宽，为300～350nm，有利于增加激发能，提高灵敏度。
4、荧光标志物的相对比活性比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。
5、信号增强镧系元素发射光谱带较窄，有效地降低了本底荧光。
镧系元素激发光谱带较宽，为300～350nm，有利于增加激发能，提高灵敏度。
（二）标志物和标记方法1、标志物用于时间分辨荧光免疫测定的标志物是镧系元素，最常用的是铕。
2、标记方法镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子-螯合剂-抗原（或抗体）复合物。
（三）方法类型1、双抗体夹心法2、固相抗体竞争法3、固相抗原竞争法（四）方法评价时间分辨荧光免疫测定灵敏度高；分析范围宽；标记结合物稳定，有效使用期长；测量快速，易自动化；无放射性污染，在灵敏度、稳定性和测量自动化程度等方面都可与放射免疫分析媲美，为目前超微量物质分析最有发展前途的一项技术。
缺点是易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子的污染，使本底增高。
二、荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质的含量。
（一）基本原理当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的平面光,称之为偏振光。
荧光物质经单一平面的偏振光（蓝光，485nm）激发后，可吸收光能并发射出相应的偏振荧光（绿光，525～550nm），偏振荧光有很强的方向性。
荧光偏振免疫测定常用异硫氰酸荧光素（FITC）标记小分子抗原。
（二）方法评价荧光偏振免疫测定样品用量少；荧光素标记结合物稳定，使用寿命长；方法重复性好；快速，易自动化；试剂盒专属性强，适于检测小分子和中等分子物质，不适宜测定大分子物质；灵敏度较非均相荧光免疫测定法低。
三、荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定是利用酶标抗原（或抗体）与待检抗原（或抗体）反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。
（一）基本原理以碱性磷酸酶（ALP）标记抗体（或抗原），以固相载体包被抗原（或抗体），以4-甲基伞酮磷酸盐（4-MUP）为碱性磷酸酶反应的荧光底物，碱性磷酸酶分解4-MUP，脱磷酸根基团后形成4-甲基伞酮（4-MU）。
4-MU 经360nm激发光照射，发出450nm的荧光，通过荧光计数仪记录所产生的荧光强度，计算出待检抗原或抗体的含量。
（二）酶和荧光底物用于荧光酶免疫测定标记的酶及荧光底物见表4-8-1，其中最常用的酶是碱性磷酸酶，最常用的荧光底物是4-甲基伞酮磷酸盐（4-MUP）。
（三）方法类型1、双抗体夹心法2、双抗原夹心法3、固相抗原竞争法（四）方法评价荧光酶免疫测定由于使用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，故灵敏度大大提高。
但血清和其他生物样品的背景荧光会干扰测定，因此用固相荧光酶免疫测定法效果好。
第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用1、自身抗体检测2、病原体检测3、免疫病理检测4、细胞表面抗原和受体检测5、流式细胞术二、荧光免疫测定的应用时间分辨荧光免疫测定应用范围十分广泛，包括蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿瘤标志物、病原体抗原／抗体。
荧光偏振免疫测定特别适用于血清或尿液中小分子物质的测定，目前已有数十种治疗药物和成瘾药物、维生素、激素及常规生化项目可用荧光偏振免疫测定进行分析和定量测定。
荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、过敏原、心肌损伤标志物和凝血因子。
临床免疫学和免疫检验
临床免疫学的重要性
01 02
疾病诊断与治疗
临床免疫学为许多疾病的诊断和治疗提供了理论基础和实践指导。例如， 通过对免疫系统的深入研究，开发出了针对肿瘤、感染性疾病、自身免 疫性疾病等的免疫疗法。
疫苗研发
疫苗的研发是临床免疫学的重要应用之一。通过了解免疫系统的应答机 制，可以设计和优化疫苗，提高预防传染病的效果。
实现免疫检测的远程监控和实 时反馈，提高检测的便捷性和 及时性。
发展新型免疫检测技术
探索新的免疫检测方法和技术，如量子点、纳米材料等新型标记物，提高免疫检测 的灵敏度和特异性。
结合生物信息学、基因组学等技术，开展多组学免疫检测，实现更全面的免疫功能 评估。
开发新型的免疫细胞分析技术，如流式细胞术、质谱技术等，对免疫细胞进行更深 入的分析和鉴定。
肿瘤的免疫诊断与治疗
肿瘤标志物检测
通过检测肿瘤标志物，有助于早 期发现肿瘤并监测治疗效果。
免疫组化染色
通过免疫组化染色技术，有助于确 定肿瘤的性质、来源和分化程度。
免疫治疗
利用免疫系统对肿瘤进行特异性攻 击，如免疫检查点抑制剂、CAR-T 细胞疗法等，为肿瘤治疗提供了新 的手段。
自身免疫性疾病的诊断与治疗
详细描述
化学发光免疫分析通过化学发光物质标记抗体或抗原，在催化剂的作用下产生化学发光，通过检测化 学发光强度对目标抗原或抗体进行定量或定性分析。该技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干扰等 优点，广泛应用于临床诊断和生物科学研究。
免疫印迹技术
总结词
一种用于检测多肽、蛋白质和核酸等生物大分子的免疫分析 技术。
优化免疫检测方法，如采用信号 放大技术、酶联免疫技术等，以
提高检测的灵敏度和特异性。
免疫学检验技术—荧光免疫技术
荧光显微镜光路图
透射荧光光路(a)
落射荧光光路(b)
三、荧光抗体染色及结果判断
• 荧光显微镜检查（结果判断）
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
“-”：无或极微弱 “+”：较弱但清晰可见
“++”：明亮
“+++”：耀眼
对照光：“-”或“±”
为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基 苯、I-等 。 * 荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；
消除非特异性荧光（本底）的干扰。
• Stokes位移 荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能
量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。 • 荧光偏振
荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并 发出单一平面的偏振荧光的现象。
知识目标
教学目标
1.熟练掌握：荧光抗体的制备及荧光抗体技术（重难点）。
2.掌握：常用的荧光物质，时间分辨荧光免疫测定（重点）、荧光偏振免 疫测定。
3.了解：荧光的基本知识、免疫芯片技术。
能力目标
1.掌握：荧光抗体技术标本的制作。
2.学会：荧光抗体染色与结果判断。
思政-素质目标
责任心、质控、生物安全意识、临床免疫学思维
（RB200 橘红）
CD4
三、关键技术
1.标本制作 2.荧光抗体染色 3.荧光显微镜检查 4.荧光抗体染色结果判读
标 组织切片：冷冻切片、石蜡切片 本 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 制 涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液 作 培养细胞：单层培养细胞
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细 胞结构欠清晰 石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第八章 荧光免疫技术
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第八章荧光免疫技术（附答案解析）1、荧光效率的决定因素是（）A、荧光素本身特性B、激发光波长C、激发光强度D、环境因素E、温度2、FITC的吸收波长为（）A、495nmB、520nmC、570nmD、450nmE、360nm3、荧光素发射荧光属于（）A、光照发光B、化学发光C、生物发光D、电化学发光E、偏振光4、纯化荧光素标记抗体时，去除游离荧光素可采用的方法是（）A、盐析法B、离子交换层析C、亲和层析D、透析法E、活性炭吸附5、下列何种方法的灵敏度最高（）A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法6、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法7、为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行对照试验。
下列选项中不必要的（）A、替代对照B、吸收试验C、阴性对照D、阳性对照E、补体对照8、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是（）A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜9、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是（）A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿10、荧光效率是（）=A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠（）A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力12、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对13、荧光免疫技术中，间接法所使用的第二抗体可以是（）A、抗种属特异性IgA荧光抗体B、抗种属特异性IgG荧光抗体C、抗种属特异性IgM荧光抗体D、以上都正确E、以上都不正14、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对15、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法16、实验本身即可避免内源性非特异性荧光干扰的检测方法为（）A、时间分辨荧光免疫测定B、荧光偏振免疫测定C、荧光酶免疫测定D、直接荧光抗体染色法E、间接荧光抗体染色法17、下述间接法描述不确切的是（）A、第一抗体为针对抗原的特异性抗体.B、第二抗体为荧光标记抗体，是针对第一抗体的抗抗体C、可用于检测抗原，也可用于检测抗体D、操作简便，特异性高E、可以用于多种抗体的检测18、下列有关间接荧光法的叙述错误的是（）A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测19、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外（）A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒20、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是（）A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光21、下列不符合荧光素标记免疫技术直接法的描述是（）A、荧光抗体直接加于标本上B、常用于抗核抗体的检测C、每检查一种抗原需制备特异的荧光素标记抗体D、灵敏度偏低E、特异性高，非特异荧光染色因素少22、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法（）A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法答案部分1、【正确答案】 A【答案解析】荧光效率的决定因素是荧光素本身特性。
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验-免疫学概论复习资料汇编
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验免疫学概论复习资料汇编学习免疫学的基本概念，了解临床免疫学的理论基础，掌握免疫技术的检测原理是学习和研究临床免疫学与免疫技术的重要保障。
一、免疫的概念宿主体内的免疫系统，能识别并清除从外环境中侵入的病原生物及其产生的毒素、内环境中因基因突变产生的肿瘤细胞、自身衰老残损的组织细胞或自身变性抗原，实现免疫防御、免疫自稳和免疫监视的功能，保持机体内环境稳定。
二、免疫系统免疫器官免疫细胞免疫分子中枢外周膜型分子分泌型分子胸腺骨髓脾脏、淋巴结、黏膜伴随淋巴组织淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）免疫辅助细胞（吞噬细胞、树突状细胞等）TCRBCRCD分子粘附分子MHC其他免疫球蛋白补体分子细胞因子（一）免疫系统-免疫器官与组织（二）中枢免疫器官（三）免疫系统-免疫细胞T细胞B细胞（四）免疫系统－免疫分子1.免疫球蛋白2.补体系统3.细胞因子4.黏附分子5.CD抗原人类白细胞分化抗原（HLA）是指血细胞在分化成熟为不同谱系、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。
采用单克隆抗体鉴定识别的自细胞分化抗原称CD抗原。
检测CD抗原是实验室识别细胞及不同分化阶段细胞或细胞亚群最主要的方法。
免疫功能生理性（有利）病理性（不利）免疫防御抗感染免疫缺陷病超敏反应免疫自稳清除损伤或衰老细胞自身免疫病免疫监视杀伤和清除异常突变细胞肿瘤持续病毒感染三、免疫应答（一）固有免疫，innate immunity。
（二）适应性免疫，adaptive immunity。
----体液免疫应答、细胞免疫应答。
四、临床免疫学临床免疫学是将免疫学基础理论、临床疾病与免疫学技术相结合，用于研究疾病的免疫病理机制、诊断与鉴别诊断、评价治疗效果和判断预后的多个分支学科的总称。
临免疫检验可分为两部分，一部分为利用免疫检测原理与技术检测免疫相关物质；另一部分是利用免疫检测原理与技术检测体液中微量物质。
临床免疫学检验 课件 第8章 荧光免疫技术
3、花菁染料 (Cyanine Dyes ，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定
性较强，荧光量子产率较高，对pH 等环境不敏感。常 用于多重染色。
Cy2比FITC 更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗 淬灭性更好。
Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更 弱。
指荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退的现象。 原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、ＫＩ、铁、汞、镍等。 有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯
处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 ? 铕(Eu 3+)（应用最广）、 铽(Tb 3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 ? 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) ? 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
（对羟基苯乙酸）的底物。 ? 应用：酶免疫荧光分析
②阻挡滤片（barrier filter ）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410～650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。
OG( 橙黄色)：
GG( 淡绿色)：
③隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线
3）镜头: 需消色差、无荧光
4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织
第八章 荧光免疫技术
Fluoroimmunoassay, FIA
荧光免疫技术
医学检验职业资格考试知识总结—免疫(下)
医学检验职业资格考试知识总结—免疫（下）荧光免疫技术1、概述①荧光色素：能产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物②主要的荧光物质（一）异硫氰酸荧光素（FITC）：显黄绿色荧光（二）四乙基罗丹明（RB200）:显橘红色荧光（三）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：橙红色荧光（四）藻红蛋白（R-RE）：橙色荧光③其他荧光物质（一）镧系螯合物：以EU3+应用最广泛，最适用于时间分辨荧光免疫测定2、荧光抗体技术①以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，标记的抗体应具有高特异性、高亲和力②荧光抗体保存：最好小分量分装保存，4℃可存1-3天3、荧光免疫分析类型①荧光免疫技术包括：荧光抗体技术和荧光免疫测定分析技术②时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）（一）原理：是用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光发热特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行分析，能有效排除非特异荧光的干扰，极大提高分析灵敏度（二）常用标记物：EU3+③荧光酶免疫测定（一）原理：利用酶标抗原或抗体，与待测抗原或抗体反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量（二）常用酶标物：碱性磷酸酶（三）常用的荧光底物：4—甲基伞酮磷酸盐（4—MUP）（四）方法类型：双抗体夹心法、双抗原夹心法、固相抗原竞争法4、荧光免疫技术的临床应用①主要临床应用（一）自身抗体检测（二）病原体检测（三）免疫病理检测（四）细胞表面抗原、抗体检测（五）流式细胞仪技术酶免疫技术1、酶免疫技术特点①原理：将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫技术，是将酶与抗原或抗体结合成酶标抗体或抗原，即保持了免疫性又有催化作用；在酶标抗体或抗原与抗原或抗体的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性、定量分析②常用酶及相应底物（一）辣根过氧化物酶（HRP）：在蔬菜作物中提取底物：邻苯二胺（OPD），四甲基联苯胺（TMB）（二）碱性磷酸酶（ALP）：从牛黏膜或大肠杆菌中提取底物：对硝基苯磷酸脂（P-NPP）（三）β—半乳糖苷酶:常用于均相酶免疫测定底物：4—甲基伞酮基—R—D半乳糖（4—MUU）③固相载体（一）板上：结合抗体或抗原的容量大，可将抗原或抗体牢牢固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落（二）包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程（三）封闭：防止非特异性反应，用1%—5%小牛血清白蛋白2、酶免疫技术的分类①酶免疫测定（一）用于液体标本中抗原或抗体的定性或定量（二）根据抗原抗体反应后是否将结合游离的酶标志物分离，酶免疫测定分为均相和异相两种类型如：Ab+E→Ab-E （游离酶标抗体）Ab-E+Ag→Ab-E-Ag（复合物）Ab—抗体E—酶Ag—抗原②均相酶免疫测定（一）原理：利用Ab-E结合Ag形成Ab-E-Ag复合物后，标记酶的活性会发生改变，可以在不将Ab-E-Ag与Ab分离情况下，通过直接测定系统中总的标记酶活性改变，即可确定Ab-E-Ag的形成，进而检测出样品中Ag的浓度③异相酶免疫测定（一）分离Ab-E-Ag复合物和单纯酶标物（Ab-E），来测定Ab-E-Ag复合物中酶活性，进而检测出Ag浓度（二）分为液相和固相酶免疫测定两类A：异相液相酶免疫测定：主要用于检测样品中极微量的激素或药物B：异相固相酶免疫测定：常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）3、酶联免疫吸附试验（ELISA）①基本原理（一）抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫性（二）将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，即保留免疫活性，又保留了酶活性（三）测定时将受检样品和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上抗原或抗体反应，形成复合物（四）用洗涤方法分离结合与游离的酶标抗体或抗原（五）加入底物显色②方法类型及反应原理（一）三个必要试剂：固相抗原或抗体、酶标抗原或抗体、酶反应底物（二）抗原测定方法Ⅰ：双抗体夹心法A：双抗体夹心法只适用于二价或二价以上的大分子抗原测定，形成固相抗体—待测抗原—酶标抗体复合物B：常用于乙肝表面抗原、甲胎蛋白、HCG等检测Ⅱ：双位点一步法A：主要针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的单克隆抗体，即包被使用一种单抗体，酶标记使用另一种单抗体Ⅲ：竞争法A：主要用于测定小分子抗原B：先用抗体包被固相载体上，然后同时加入待测抗原和酶标抗原，待测抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合，温育、洗涤、加酶底物显色（三）抗体测定方法Ⅰ：间接法A：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本，使样本中待测抗体与固相载体上抗原结合，再加入酶标二抗，在固相载体上形成固相抗原—待测抗体—酶标二抗复合物，加入底物显色B：常用于丙型肝炎抗体测定、人类免疫缺陷病毒抗体等Ⅱ：双抗原夹心法A:适用于大分子抗体，具有两个及以上的接触位点，原理同双抗体夹心法B：常用于乙型肝炎表面抗体的测定Ⅲ：竞争法A：主要检测小分子抗体B：常用于乙型肝炎核心抗体、e抗体的检测IV：捕获法A:主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgG、lgM、lgA等）的测定，目前最常用的是病原体急性感染诊断中的lgM型抗体B：将抗lgM抗体包被在固相载体上，加入待测lgM抗体，特异性结合化学发光免疫技术1、概述①化学发光：指伴随化学反应过程，所产生的光的发射现象②发光：指分子、原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再回到基态并释放光子的过程2、化学发光免疫分析由两个系统组成①化学发光系统：利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态中间体，当这种激发态中间体回到基态时，同时发射出光子，利用光信号测量仪器测量光量子②免疫反应系统：将发光物质直接标记在抗原或抗体上3、直接发光剂①在发光免疫分析过程中，不需要酶的催化作用②包括：吖啶酯和三联吡啶钌4、酶促反应发光剂①利用标记酶的催化作用，使发光剂发光②目前标记酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶5、化学发光免疫分析类型①直接化学发光免疫分析：常用吖啶酯②化学发光酶免疫分析③电化学发光免疫分析：常用三联吡啶钌免疫细胞的分离及其表面标志检测技术1、免疫细胞的分离①外周血单个核细胞分离（一）2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合，可作为淋巴细胞分离液，即Ficoll分离液（二）Ficoll分离液主要用于外周血单个核细胞分离，由上到下为：稀释血浆层、单个核细胞层、粒细胞层、红细胞层（三）从外周血分离得到的纯淋巴细胞群，再分离T、B淋巴细胞，常用方法：E花环沉降法、尼龙毛柱分离法、亲和板结合分离法（四）分离细胞的保存及活力测定A：短期保存：4℃B：长期保存：液氮深低温（-196℃）环境保存，加入二甲亚砜作为保护剂C：活力测定最常用：台盼蓝染色法；死细胞着色，活细胞不着色2、T淋巴细胞标志及亚群分类①T细胞表面标志及其亚群（一）所有T细胞均有共同的标志性抗原：CD3（二）辅助性T细胞（Th）：CD3+、CD4+、CD8-（三）杀伤/细胞毒性T细胞（TC或CTL）：CD3+、CD4-、CD8+（四）调节性T细胞（Tr）：CD4+、CD25+②T细胞表面主要的CD抗原（一）CD2：是T细胞与NK细胞共有，又称“绵羊红细胞受体”（二）CD3：全部T细胞表面都有（三）CD4/CD8：区分T细胞亚群重要标志；CD4主要为Th，CD8主要为TC（四）T细胞表面识别受体TCR③辅助性T细胞（Th）（一）Th1：主要分泌IL-2、IFN-α、TNF-β等细胞因子，辅助细胞免疫，参与迟发型超敏反应（二）Th2：主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，辅助体液免疫，参与速发型超敏反应④T细胞表面受体：抗原受体、绵羊红细胞受体、细胞因子受体、lgFc受体、丝裂原受体、E受体3、B淋巴细胞表面标志①B细胞表面受体：膜免疫球蛋白（Smlg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体（一）膜免疫球蛋白（Smlg）：又称BCR，是B细胞最具有特征的表面标志（二）Smlg主要作用结合特异性抗原，也叫抗原受体（三）成熟B细胞的Smlg主要为SmlgM和SmlgD②人T细胞与B细胞区别在于lg表面标志，T细胞与B细胞表面共有标志是PWM-R③成熟B细胞表达：CD10、CD19、CD20、CD21、CD22（一）成熟B细胞均表达CD19（二）根据有无CD5表达可分为：B1淋巴细胞（表达CD5）和B2淋巴细胞（不表达CD5）4、NK细胞表面标志①NK细胞表面标志：CD16、CD565、淋巴细胞功能检测①T淋巴细胞功能检测：H-TdR掺入法②B淋巴细胞功能检测：溶血空斑试验③NK细胞功能检测：酶释法6、其他免疫细胞①抗原提呈细胞（APC）（一）概念：摄取、加工、处理抗原，并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞（二）APC分类A:专职APC：包括巨噬细胞、树突状细胞、B细胞它们均表达MHC-Ⅱ类分子B：非专职APC：包括内皮细胞、激活T细胞等②单核—吞噬细胞（一）包括骨髓内的单核细胞、外周血中单核细胞、组织内的吞噬细胞（二）典型表面标志：CD14③树突状细胞（DC）（一）主要来源：骨髓粒系和淋巴系（二）成熟DC主要表面标志：CD83、CD1、CD117、淋巴细胞表面标志检测的临床意义①在评价免疫功能时常采用CD4/CD8的比值②CD4是HIV受体，CD4/CD8会下降③CD4/CD8上升见于自身免疫性疾病；CD4/CD8下降见于病毒感染、恶性肿瘤、再障等免疫细胞功能检测1、免疫细胞大致分两类①一类能识别特异性抗原，一旦被激活则显示出特异性应答功能，主要是淋巴细胞②另一类能捕获抗原，处理抗原，从一定方式提呈给淋巴细胞，主要是吞噬细胞、树突状细胞2、各免疫细胞的功能检测①中性粒细胞功能检测：硝酸四氮唑蓝还原试验（NBT）②吞噬细胞功能检测：炭粒廓清试验③B细胞功能检测：溶血空斑试验④T细胞功能检测：淋巴细胞转化试验⑤NK细胞功能检测：酶释法流失细胞分析仪技术1、概述①基本原理（一）检测的是单个细胞（二）检测的是细胞内或细胞外附着的分子（三）流式就是被检测细胞排成队，一个挨一个通过检测系统，根据细胞附着分子染色的不同，而被检测出来如：T淋巴细胞表面CD3被染成红色，B淋巴细胞表面CD20被染成绿色②流式细胞仪组成（一）由液流系统、光学系统、信号转换测试系统、信号处理的计算机系统组成，可对细胞悬液中的单个细胞、特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析（二）液流系统：样本、鞘液组成（三）光学系统：激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组、滤片、光电倍增管（四）数据处理系统：计算机及软件组成③细胞分选原理（一）在实验时设定了被分选细胞的特性参数，当系统一检测到此参数时，就让此细胞落入指定的收集器中，完成细胞分选目的2、数据的显示与分析①流式细胞仪收集细胞产生各种电讯号，最终以数字及图式形式表示②免疫分析中常用的荧光染料与标记染色（一）异硫氰酸荧光素（FITC）：亮绿色荧光（二）德州红：红色荧光（三）藻红蛋白（PE）：橙黄色（四）碘化丙啶（PI）：橙红色（五）别藻青蛋白（APC）：红色（六）多甲藻黄素叶绿素蛋白：深红色③免疫胶乳颗粒技术（一）对于细胞上附着的可溶性分子，可以把可溶性分子标志在颗粒上，然后形成细胞—颗粒—可溶性分子进行检测④光信号（一）发射光波长与激发光波长间有较大波长差，荧光染料对488nm激发光有强吸收（二）侧向角散射光信号与细胞内颗粒复杂程度有关，急内部结构（三）前向角散射光信号与细胞大小有关体液免疫球蛋白测定1、概述①免疫球蛋白（lg）是由浆细胞合成和分泌的一组具有抗体活性的蛋白质，按其重链分lgG、lgA、lgM、lgD、lgE②免疫球蛋白亚型（一）lgG有4个亚型：lgG1、lgG2、lgG3、lgG4（二）lgA有2个亚型：lgA1、lgA2和分泌型lgA（三）lgM有2个亚型：lgM1、lgM22、血清lgG、lgA、lgM、lgD、lgE测定①血清lgG（一）lgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，其中以lgG1含量最多（二）lgG是血液和组织外液中的主要抗体（三）是机体再次免疫应答的主要抗体（四）可通过胎盘（五）大多数抗感染抗体和自身抗体都为lgG②血清lgA（一）由血清型和分泌型两种（二）是参与黏膜局部免疫的主要抗体，主要是胃肠道、初乳、唾液、泪液、支气管等感染（三）分泌型lgA与骨质破坏的严重程度有关③血清lgM（一）是分子量最大的lg，又称巨球蛋白（二）为五聚体（三）是个体中最早合成和分泌的抗体（四）体液免疫中最早产生的抗体（五）感染期lgM水平升高，说明近期感染；lgG升高，说明后期感染（六）新生儿脐血中lgM增高，提示宫内感染④血清lgD（一）膜结合型lgD构成BCR，是B细胞分化发育成熟的标志（二）未成熟B细胞仅表达mlgM，成熟B细胞可同时表达mlgM和mlgD⑤血清lgE（一）lgE是正常人血清中含量最少的lg（二）lgE为亲细胞抗体，可引起Ⅰ型超敏反应（三）lgE与机体抗寄生虫有关（四）lgE升高常见于系统性红斑狼疮（SLE）；降低见于原发性无丙种球蛋白血症、肿瘤及化疗药物后3、尿液及脑脊液lg测定①尿液lg测定及临床意义（一）正常人尿液中lg含量甚微，当肾小球滤过膜轻微损伤时，尿中以lgG增多为主；严重损伤时lgG增多外，大分子量lgM也增多（二）临床上常用尿液和血液中的转铁蛋白（TRF）及lgG含量来计算选择性蛋白尿指数（SPI），来评估肾小球滤过膜破坏程度SPI=（尿lgG/血lgG）/（尿TRF/血TRF）SPI≤0.1表明肾脏有高度选择性的排泌分子量较小的蛋白质，此时损伤较小SPI≥0.1表明肾脏是非选择性排泌分子量较大蛋白质，损伤较严重②脑脊液lg测定及临床意义（一）lgG、lgA、lgM在脑脊液中浓度依次递减（二）临床主要通过测定白蛋白商值，来反映脑屏障受损程度（三）脑脊液lgG升高，见于化脓性脑膜炎、脑血管疾病等4、M蛋白测定及临床意义①M蛋白：是B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖所产生的异常单克隆免疫球蛋白，多无免疫活性②检测M蛋白方法（一）筛选M蛋白最基本方法：血清蛋白区带电泳技术（二）M蛋白的初筛试验：血清免疫球蛋白定量测定（三）鉴定M蛋白最常用方法：免疫固定电泳③临床意义（一）临床上多用于多发性骨髓瘤、高丙种球蛋白血症5、轻链球蛋白测定及意义①本—周蛋白（一）本—周蛋白：尿中游离的免疫球蛋白轻链（二）检测方法：化学法（加热沉淀法）和免疫法（三）检测本—周蛋白对轻链病的诊断是必不可少的，常见于多发性骨髓瘤（四）本—周蛋白分子量很小，极易迅速由肾脏排出，血中反而阴性6、冷球蛋白检测①冷球蛋白：又称冷免疫球蛋白，是一组在低温下发生沉淀，加热后复溶的免疫球蛋白，一般在4℃时发生沉淀，37℃时复溶②冷球蛋白分型（一）Ⅰ型：为单克隆冷球蛋白型，最常见lgM增高，多见于恶性疾病，如肿瘤、多发性骨髓瘤（二）Ⅱ型：单克隆和多克隆混合型冷球蛋白，常见lgM，偶见lgG，多见于恶性疾病前期，如自身免疫性疾病（三）Ⅲ型：多克隆混合型冷球蛋白补体检测1、概述①补体：是一组存在人和脊椎动物血清中具有酶样活性，不耐热的糖蛋白②补体成分含量与理化特征（一）补体成分含量A：补体大多数为糖蛋白，属于β球蛋白B：正常血清中补体含量最高的是C3，含量最少的是C2（二）补体理化特征A：灭活条件，加热56℃30minB：补体性质不稳定，具有酶阳活性③补体的活化途径（一）经典途径（二）旁路途径（三）MBL途径2、补体总活性测定①CH50测定原理（一）补体最主要活性是溶细胞作用（二）溶血反应对补体剂量呈S形曲线（三）实验常以50%溶血作为终点指标（四）在补体参与的溶血实验中，应使用2个单位的溶血素②补体活性检测方法（一）基于经典途径的CP—CH50和应用于C3旁路途径检测AP—CH50（二）CP—CH50是临床常规进行的补体总活性检测项目3、单个补体成分测定①30多种补体中C1、C3、C4、B因子常作为单个补体成分检测指标②测定方法（一）免疫溶血法：检测单个补体的活性（二）血清学法：检测单个补体含量A：免疫溶血法：根据抗原与其特异性抗体结合可激活补体经典途径导致细胞溶解B：免疫化学法：透射比浊法、散射比浊法4、补体结合试验（CFT）①补体结合试验：由反应系统、指示系统、补体系统三大系统组成，主要是利用补体的溶血作用进行抗原、抗体检测②反应系统：用已知抗原或抗体来检测相应抗体或抗原，多采用方阵法进行滴度，选择抗原、抗体最适比例，呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价③指示系统：免疫溶血机制④临床应用（一）用于华氏反应检测梅毒（二）HLA分型的补体依赖性细胞毒试验超敏反应性疾病及其免疫检测1、概述①超敏反应：又称变态反应，指机体对某些抗原初次应答致敏后，再次接触相同抗原刺激时，所出现的一种生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的异常免疫应答②超敏反应包括：Ⅰ型超敏反应、Ⅱ型超敏反应、Ⅲ型超敏反应、Ⅳ型超敏反应2、各型超敏反应特征及临床意义①Ⅰ型超敏反应（一）由特异性lgE抗体介导产生，其发生速度最快，又称速发型超敏反应（二）发生机制A：变应原：某些药物，如青霉素；花粉、食物，如奶等B：抗体：特异性lgE抗体，称为变应素C：细胞参与：肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞（三）发生过程A：致敏阶段：当变应原首次进入机体，可选择性诱导B 细胞产生lgE抗体，使机体对该变应原致敏状态B：激活阶段：处于致敏状态的机体，再次接触相同变应原C：效应阶段：根据效应作用发生的快慢和持续时间长短（四）Ⅰ型超敏反应免疫学检查A：皮肤试验，阳性呈红晕、红斑、瘙痒②Ⅱ型超敏反应（一）又称细胞毒型或细胞溶解型超敏反应（二）是由靶细胞表面的抗原与相应lgG或lgM抗体结合后，在补体、巨噬细胞、NK细胞参与下，引起以细胞溶解或组织损伤为主的病理性免疫反应（三）常见Ⅱ型超敏反应性疾病A：输血反应B：新生儿溶血症C：自身免疫性溶血性贫血D：血小板减少性紫癜E：格雷夫斯病（Graves病）③Ⅲ型超敏反应（一）又称免疫复合型或血管炎型超敏反应（二）由可溶性免疫复合物沉积于局部或全身多处毛细血管基底膜，通过激活补体并在血小板、中性粒参与下，引起充血性水肿、局部坏死、中性粒细胞浸润为主要特征的炎症反应和组织损伤（三）发生机制A：中等大小免疫复合物的形成B：可溶性复合物沉积C：免疫复合物沉积引起免疫组织损伤（四）临床意义A：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等④Ⅳ型超敏反应（一）又称迟发型超敏反应（二）是效应T细胞与特异性抗原结合后，引起以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应（三）发生机制A:抗原主要是胞内寄生菌、病毒、寄生虫等B：效应T细胞主要是：CD4+和CD8+细胞（四）常见疾病A：结核菌素反应、传染性超敏反应、接触性皮炎、移植排斥反应自身免疫性疾病及其免疫检测1、概述①自身免疫：指某些情况下，机体免疫系统对自身成分发生免疫应答，多数情况下病因不清楚②自身抗原：一系列生物、物理、化学因素引起自身组织结构与成分发生改变，并能引起机体免疫系统针对这些组织细胞成分产生免疫应答反应2、常见自身免疫性疾病①由Ⅱ型超敏反应引起自身免疫性疾病（一）自身免疫性溶血性贫血（二）免疫性血小板减少性紫癜②自身抗体—免疫复合物引起的自身免疫性疾病（Ⅲ型超敏）（一）系统性红斑狼疮（SLE）（二）类风湿性关节炎（三）干燥综合征③T细胞对自身抗原应答引起的自身免疫性疾病（Ⅳ超敏反应）（一）Ⅰ型糖尿病（二）多发性硬化症3、常见自身免疫性疾病的自身抗体检测①抗核抗体（ANA）（一）指将自身真核细胞的各种细胞成分作为靶细胞（二）ANA分类A：抗DNA抗体B：抗组蛋白抗体C：抗核仁抗体D：抗非组蛋白抗体（三）目前常用间接免疫荧光法作为ANA筛选试验②抗中性粒细胞浆抗体（ANCA）（一）分型：胞浆型（CANCA）和核周型（PANCA）（二）特异性ANCA检测最常用ELISA法③抗线粒体抗体（AMA）（一）常用间接免疫荧光法检测4、常见疾病对应的自身抗体检测①临床常见（一）重症肌无力：AchR阳性（乙酰胆碱）（二）干燥综合征：抗SSA抗体、抗SSB抗体（三）原发性胆汁性肝硬化：抗线粒体型（四）Ⅰ型自身免疫性肝炎：抗平滑肌抗体（五）进行性系统性硬皮症（PSS）：抗SCl—70抗体（六）多发性肌炎：抗Jo—1抗体（七）强直性脊柱炎：HLA—B27（八）痛风性关节炎：尿酸（九）风湿性关节炎：ASO（抗链球菌溶血素）（十）类风湿关节炎：抗CCP抗体、抗lgG抗体、类风湿因子（RF）、抗角蛋白抗体（AKA）免疫缺陷性疾病1、概述①免疫缺陷：由遗传因素或其他原因造成的免疫系统发育或免疫应答障碍，从而导致的一种或多种免疫功能不全2、常见免疫缺陷疾病①获得性免疫缺陷综合征（AIDS）（一）又称艾滋病（HIV）（二）患者以CD4+T细胞减少为主要特征（三）常用ELISA法检测HIV的核心抗原P24，该抗原主要出现在急性感染期和晚期（四）初筛试验：ELISA、乳胶凝集法、免疫层析法（五）确诊试验：免疫印迹法（IBT）②Bruton综合征（一）是原发性B细胞免疫缺陷（二）检测方法：免疫球蛋白检测③Di—George综合征（一）是原发性T细胞免疫缺陷（二）检测方法：淋巴细胞增殖反应试验④慢性肉芽肿（一）是原发性吞噬细胞缺陷（二）检测方法：粘附分子测定肿瘤免疫与免疫学检验1、肿瘤抗原①定义：指在肿瘤发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原物质②肿瘤特异性抗原：是肿瘤细胞所持有的新抗原，它只表达于肿瘤细胞而不存在于正常组织细胞③肿瘤相关性抗原：指非肿瘤细胞所持有，正常细胞或组织可表达的抗原物质，但此类抗原在癌变细胞的表达水平远远超过正常细胞2、抗肿瘤的细胞免疫机制①参与抗肿瘤免疫的细胞主要是：T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞3、肿瘤免疫学检验①肿瘤标志物：指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者由机体对肿瘤细胞反应所产生，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、多胺、癌基因产物4、常见肿瘤标志①胚胎抗原类标志物（一）甲胎蛋白（AFP）升高见于原发性肝癌、病毒性肝炎、肝硬化（二）癌胚抗原（CEA）升高见于结肠癌、肠道息肉、直肠癌（三）鳞状细胞癌抗原（SCC）见于子宫颈癌②糖链抗原类（一）CA153：多见于乳腺癌（二）CA125：多见于卵巢癌（三）CA199：多见于胰腺癌、又与胃肠癌相关（四）CA724：多见于胃癌③酶类（一）前列腺特异性抗原（PSA）：多见于前列腺癌（二）神经元特异性烯醇化酶（NSE）：多见于小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤。
医学免疫学荧光免疫技术资料
荧光(yíngguāng)抗体
• 荧光抗体(kàngtǐ)染色技术中常用的标记荧光物质
异硫氰酸荧光素 （FITC）
最大吸收 (xīshōu)波长
495nm
最大发射波长 525nm，黄绿色
四乙基罗丹明 （RB200）
570nm
595nm，红色
四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC）
550nm
的荧光 • 非特异性荧光 • 背景荧光 • 洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附
第九页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体染色法
• 技术类型 • 直接法 • 间接(jiàn jiē)法 • 补体结合法 • 双标记法
第十页，共18页。
• 原理(yuánlǐ)
直接(zhíjiē)法
荧光 荧光抗体
待测标本
第三页，共18页。
基质(jī zhì)片
• 将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原 • 根据标本来源不同可分为 • 组织印片、组织切片(qiē piàn)、细胞涂片、细菌涂片 • 制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存
第四页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体
• 用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成 • 荧光的基本知识 • 自然界某些物质能从外界吸收(xīshōu)能量（光能、化学能），
基本概念
• 抗原抗体反应具有高度特异性
• 荧光物质的检测具有灵敏性和直观性
• 荧光免疫技术是将两者有机的结合起来
• 将荧光物质与抗原（抗体）连接(liánjiē)，形成荧光标记物
• 再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光 强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测
• 按技术原理及用途分为
最新初级检验士考试(临床免疫学和免疫检验)练习题第八章荧光免疫技术资料
第八章荧光免疫技术一、A11、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜2、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿3、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒4、下列何种方法的灵敏度最高A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法5、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法6、免疫荧光技术的基本原理是A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对7、下列有关间接荧光法的叙述错误的是A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测8、荧光效率是（）。
A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率9、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光10、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力答案部分一、A11、【正确答案】D【答案解析】组成荧光显微镜的结构中，只有目镜与普通光学显微镜相同。
2021临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》讲义精讲
第一章概述考试科目：1.基础知识2.相关专业知识3.专业知识4.专业实践能力考试题型：1.A1型题（最佳选择题）2.A2型题（病历摘要型最佳选择题）3.A3型题（病历组摘要型最佳选择题）4.B型题（配伍题）辅导重点1.找出重点即考点2.360度掌握考点3.结合题型攻破考点花最少的时间，收获最多的知识和能力通过考试是硬道理第一章概述第一节免疫学简介第二节临床免疫学第三节临床免疫学与临床检验第一节免疫学简介一、免疫学概念与免疫应答二、免疫组织与器官三、免疫细胞四、免疫分子一、免疫学概念与免疫应答的基本概念（一）免疫是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能（二）免疫应答是指机体免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程1.识别阶段是巨噬细胞等抗原递呈细胞对外来抗原或自身变性抗原进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给T辅助细胞（THc）及相关淋巴细胞的阶段。
2.活化阶段是T、B淋巴细胞在接受抗原信号后，在一系列免疫分子的参与下，发生活化、增殖、分化的阶段。
由于T细胞和B细胞表面表达的细胞膜受体不同，所以对抗原的识别具有严格的特异性。
B细胞接受抗原刺激后活化、增殖、分化为浆细胞，T细胞在接受抗原刺激和协同刺激双信号后活化、增殖、分化为效应细胞。
3.效应阶段是浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能。
T细胞中的Th细胞分泌细胞因子等效应分子，T杀伤细胞执行细胞毒效应功能。
另有少量T细胞和B细胞在增殖分化后，不直接执行效应功能，而作为记忆细胞。
当其再次遇到相同抗原时，迅速活化、增殖、分化为效应细胞，执行高效而持久的特异性免疫效应功能。
（三）免疫系统的三大功能1.免疫防御2.免疫自稳3.免疫监视二、免疫组织与器官（一）中枢免疫器官1.骨髓骨髓是重要的造血器官，是成年人和动物所有血细胞及淋巴细胞的发源地，多能造血干细胞（HSC）在骨髓中增殖，生成更多的HSC。
HSC分化、发育、成熟为各种血细胞，骨髓是从HSC分化发育为功能性B细胞的唯一器官。
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验-酶免疫技术 复习资料汇编
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验酶免疫技术复习资料汇编概念：酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。
既保留了抗体或抗原的免疫学活性，又保留了酶对底物的催化活性和生物放大作用。
可通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反应的敏感性。
一、酶免疫技术的特点既保留了抗体或抗原的免疫学活性，又保留了酶对底物的催化活性和生物放大作用。
可通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反应的敏感性。
（一）酶的要求一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物，用酶标记抗体或抗原建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度，为此用于标记的酶应符合下列要求：1.酶的活性要强，转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，活性保持稳定。
3.作用专一性强，无内源性酶或抑制物。
4.易于判断或测量，方法简单、敏感和重复性好。
5.无害，易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）；HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。
HRP的纯度用RZ表示，它是以HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值来表示的。
用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
2.碱性磷酸酶（AP）AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。