【实验操作】蛋白质的提取和分离实验操作
动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤
动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤步骤一：收集和处理样品首先，需要收集要研究的动物细胞或组织样品。
样品可以是从细胞培养物中收集的细胞，也可以是从动物体内收集的组织。
在收集样品之前，可以用生理盐水冲洗样品，以去除与研究无关的物质。
步骤二：细胞破碎和组织研磨接下来，需要将细胞破碎或组织研磨，以释放细胞内或组织内的蛋白质。
对于细胞破碎，可以使用一些方法，如机械破碎、超声波破碎或冻融破碎等。
对于组织研磨，可以使用搅拌器或研磨器等工具进行研磨。
步骤三：离心步骤四：蛋白质提取将经过离心的上清液取出，即为蛋白质提取物。
蛋白质提取液可以选择不同的组成，以适应研究的目的。
一般来说，一个典型的蛋白质提取液可能包含以下成分：蛋白酶抑制剂（如PMSF）、还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）、溶解剂（如甲醇或异丙醇）、洗涤剂（如Triton X-100或Tween-20）以及缓冲液（如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液）等。
这些成分对于蛋白质的稳定性、可溶性和抽提效果起着重要作用。
步骤五：蛋白质浓缩为了浓缩蛋白质，可以使用一些方法，如醋酸沉淀、有机溶剂沉淀或钙盐沉淀等。
这些方法可以使蛋白质从提取液中沉淀下来，以减少液体体积并提高蛋白质浓度。
步骤六：蛋白质分析最后，可以对蛋白质抽提物进行分析。
常用的蛋白质分析方法包括SDS-凝胶电泳、Western blotting、质谱分析等。
这些方法可以用于分析蛋白质的分子质量、浓度、结构和功能等。
总结起来，动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤包括：收集和处理样品、细胞破碎和组织研磨、离心、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质分析。
这些步骤的选择和优化将根据具体的实验目的和要求进行调整。
生物提纯分析实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握生物样品中目标蛋白的提取、纯化技术。
2. 了解不同生物分离方法的原理和应用。
3. 掌握蛋白质电泳、光谱分析等检测技术。
4. 分析实验结果，评估提纯效果。
二、实验原理本实验以某种生物样品（如细胞裂解物）为原料，通过一系列的分离纯化步骤，提取目标蛋白。
主要分离纯化方法包括：1. 粗分离：利用细胞破碎、匀浆等手段，将生物样品中的细胞膜、细胞器等结构破坏，释放出蛋白质。
2. 盐析：通过调节溶液的离子强度，使目标蛋白从溶液中沉淀出来。
3. 凝胶过滤：利用不同分子大小的蛋白质在凝胶介质中的迁移速率差异，实现蛋白质的分离。
4. 离子交换层析：根据蛋白质电荷差异，通过离子交换树脂实现蛋白质的分离。
5. 亲和层析：利用蛋白质与特定配体的特异性结合，实现蛋白质的分离。
目标蛋白的鉴定主要通过以下技术：1. SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE电泳，将蛋白质样品分离成不同分子量组分，并通过染色观察目标蛋白的位置。
2. Western blot：将SDS-PAGE电泳后的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，利用特异性抗体与目标蛋白结合，实现目标蛋白的鉴定。
3. 光谱分析：通过紫外-可见光谱、荧光光谱等手段，分析目标蛋白的纯度和活性。
三、实验仪器和药品仪器：1. 离心机2. 超声破碎仪3. 凝胶过滤柱4. 离子交换层析柱5. 亲和层析柱6. 电泳仪7. 显微镜8. 紫外-可见分光光度计药品：1. 细胞裂解液2. 盐析试剂3. 凝胶过滤介质4. 离子交换树脂5. 亲和层析配体6. 抗体7. 蛋白质标记染料8. 其他试剂四、实验操作1. 粗分离：将生物样品加入细胞裂解液，超声破碎细胞，离心收集上清液。
2. 盐析：将上清液加入盐析试剂，室温放置一段时间，离心收集沉淀。
3. 凝胶过滤：将沉淀复溶于适量缓冲液，过凝胶过滤柱，收集目标蛋白峰。
4. 离子交换层析：将凝胶过滤后的目标蛋白溶液过离子交换层析柱，收集目标蛋白峰。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
实验记录-Western-Blot之蛋白的提取与定量
细胞蛋白的提取与测定蛋白提取原理：蛋白质是一切生命活动的承担者，为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究，进一步阐明众多疾病的机制，同时为疾病治疗提供理论依据，因此需要提取目的蛋白，由于蛋白质种类繁多，结构复杂，需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。
一、贴壁细胞蛋白的提取：（所有操作均在冰上进行）准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用1.裂解液制备：每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解），配好后冰上备用；2.此处以6孔板为例，吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液，清洗 2-3次，吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；3.加入适当体积的裂解液，让裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min；4.裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞及裂解液吸入离心管，放离心机4℃12000rpm 离心30min（离心机提前预冷），上清即为蛋白溶液，细胞碎片沉降于底部；5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot，需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同，例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。
二、组织中总蛋白的提取：1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，（有的需要加入液氮），直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；2.裂解液制备：取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)；3.取适量研磨的匀浆放入离心管，加入配好的裂解液，冰上孵育40min；4.离心：4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清；5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。
蛋白质检测操作规程最新
蛋白质检测操作规程最新《蛋白质检测操作规程》一、实验室安全操作规程1. 实验室应具备必要的安全设施，如安全淋浴器，消防器材，急救箱等。
2. 操作人员应穿戴好实验室服装、手套和护目镜，并在操作过程中避免接触有害物质。
3. 实验室内禁止饮食，操作台面应保持清洁整洁，避免交叉污染。
二、蛋白质检测操作规程1. 样品准备：取得待测样品，根据要求进行样品制备，如细胞抽提、蛋白质提取等。
2. 蛋白质浓度检测：采用比色法或荧光法等方法，测定待测样品中蛋白质的浓度，并根据需求稀释样品。
3. 凝胶电泳：将待测蛋白质样品加入凝胶样品槽，进行蛋白质分离，检测蛋白质的分子量。
4. Western blot：将分离的蛋白质转移到膜上，然后用特异性抗体探测需要的蛋白质。
5. 结果分析：根据Western blot结果，判断目标蛋白质的表达情况，经过定量分析，得出相应的实验数据。
三、实验记录和报告1. 操作人员应记录实验的详细过程、使用的试剂和仪器型号、操作步骤、实验数据等内容。
2. 实验完成后，应将实验记录整理成报告，包括实验目的、原始数据、结果分析和结论等部分。
四、仪器设备维护和清洁1. 实验后及时清洁和消毒使用过的实验仪器和设备，确保下次使用前的卫生安全。
2. 定期对实验室仪器进行检查和维护，保证仪器正常使用。
五、结果存档和数据管理1. 所有实验记录和报告要有相应的存档，并按照规定的时间要求保存。
2. 实验数据的管理应该做好备份，并防止数据丢失或篡改。
通过以上《蛋白质检测操作规程》，实验室可按照规程科学、规范的开展蛋白质检测工作，确保实验数据的准确性和实验室的安全运行。
蛋白分离纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质分离纯化的基本原理和操作方法。
2. 学习不同分离纯化技术的应用。
3. 提高实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和功能。
蛋白质分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
本实验采用多种分离纯化技术，包括：材料预处理、细胞破碎、离心分离、沉淀分离、膜过滤分离和色谱分离等，实现对蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR产物、琼脂糖、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、玻璃棒、培养箱、无菌操作台等。
四、实验步骤1. 蛋白质提取（1）将大肠杆菌细胞培养至对数生长期。
（2）收集细胞，用玻璃棒搅拌，加入预冷的提取缓冲液，低温条件下进行细胞破碎。
（3）离心分离，取上清液即为蛋白质粗提液。
2. 蛋白质沉淀（1）向蛋白质粗提液中加入一定量的硫酸铵，搅拌溶解。
（2）离心分离，收集沉淀，即为蛋白质沉淀。
3. 蛋白质溶解（1）将蛋白质沉淀溶解于适量的缓冲液中。
（2）调整pH值，使蛋白质处于适宜的溶解状态。
4. 蛋白质分离纯化（1）离子交换色谱：将蛋白质溶液上样至离子交换柱，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
（2）凝胶过滤色谱：将蛋白质溶液上样至凝胶过滤柱，用缓冲液进行洗脱，收集目标蛋白峰。
5. 蛋白质鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质分子量。
（2）考马斯亮蓝R-250染色：观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质提取：通过细胞破碎和离心分离，成功提取出大肠杆菌细胞中的蛋白质。
2. 蛋白质沉淀：硫酸铵沉淀法成功地将蛋白质从粗提液中分离出来。
3. 蛋白质溶解：调整pH值后，蛋白质成功溶解于缓冲液中。
4. 蛋白质分离纯化：离子交换色谱和凝胶过滤色谱成功地将目标蛋白从粗提液中分离出来。
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
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实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
(1)样品处理
①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。
洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。
②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。
蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。
③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。
第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。
(2)凝胶色谱操作
①凝胶色谱柱的制作
②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。
计算所用凝胶量，并称量。
凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。
色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。
装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。
③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。
使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。
加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。
等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。