酶的发酵生产
酶工程 第三章酶的发酵生产 第一节酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。
的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。 起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β—半 乳糖苷酶的合成等。
酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。
第一节 酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
(B)
图3-4酶生物合成的诱导作用 （A）-----无诱导物时 （B）----添加诱导物时
转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
酶的发酵生产
分解代谢物阻遏
定义：容易利用的基质（常为碳源）阻遏某些酶 （主要是诱导酶）生物合成的现象。
cAMP receptor protein
第四节 酶的发酵生产技术
一、微生物发酵产酶方式
1、固体培养 利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷 壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供 微生物生长和产酶用。 浅盘法、转桶法、厚层通气法
含菌体较少，利于产品分离。 缺点：（1）不能强烈搅拌；（2）技术要求高，传质 传热效果差（氧气供给，温度控制。培养基成分的控 制）；理论研究阶段；（3）只适用于胞外酶的生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期）
优点：（1）解除细胞壁扩散障碍，可使胞内物质分泌 到胞外，变革了胞内酶的生产工艺和技术路线；（2） 可使细胞胞间质中的物质，如碱性磷酸酶等变为胞外 产物；（3）稳定性良好，可反复或连续使用。 。缺点：（1）原生质体的制备比较复杂；（2）发酵培 养基中需维持较高的渗透压；（3）要防止细胞壁再生
河南科技学院
第二章 酶的发酵生产
Producting Enzyme by Fermention
第一节 酶的生产方法
一、酶的生产：指经过预先设计，通过人工操 作控制而获得所需的酶的过程。 二、酶的生产方法 1、提取法：最早采用的方法，现仍继续使用。 指采用各种提取、分离技术从动、植物或微 生物细胞或组织中将酶提取分离出来。 优缺点：方法简单，有时候需先培养含酶组织 或细胞而使工艺路线变得复杂，且产品杂质 多造成分离纯化困难。
பைடு நூலகம்
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
纤维素酶 半纤维素 酶 里氏木霉、黑曲霉
木霉、曲霉、根霉
水洗布生产，饲料添加剂，消 化植物细胞壁 饲料添加剂，消化植物细胞壁， 低聚木糖生产
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
酶的发酵生产
酶工程•第一章绪论•第二章酶的发酵生产•第三章酶的分离纯化•第四章酶分子修饰•第五章酶与细胞固定化•第六章酶反应动力学•第七章酶的应用第一章绪论•第一节酶的概述•第二节酶工程概述•第三节酶的生产方法•第四节酶的应用前景第一节酶的概述一. 酶(enzyme)的概念二. 酶的研究历史三. 酶的分类与命名四. 酶的活力测定一. 酶(enzyme)的概念1.酶是催化剂（catalyst）所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。
酶在化学反应中就是充当这样的角色。
2.酶是一种特殊的催化剂3.酶是生物催化剂酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。
其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。
（1）酶具有催化的高效性酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。
如：2H2O2 2H2O + O2该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：5.6×10-4mol/mol Fe+.S、6.0×10-1mol/mol血红素.S、3.5×106mol/mol过氧化氢酶.S（2）酶具有催化的高度专一性(specificity)酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。
酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：a. 绝对专一性：酶只能催化一种反应物发生反应的特性如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。
b. 相对专一性：酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。
如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。
淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。
c. 异构专一性：酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。
称为酶的发酵生产
第 2章
酶的发酵生产
（2） 种子质量的控制措施
菌种稳定性检查：保藏菌种
无（杂）菌检查：显微镜观察，肉汤或琼脂斜面培养 生化分析：养分消耗速度，pH变化，溶解氧利用， 色泽，气味等
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
国内菌种保藏机构
ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所
发生退化菌种的复壮和菌种退化之前的复壮和提高。
酶工程
第 2章
酶的发养
保藏菌种 试管斜面活化 三角瓶培养
种子罐培养
2. 种子制备的过程 防止杂菌污染，减少转接次数，避免种子培养基的长
时高温灭菌；培养基及培养条件是细胞生长繁殖的最适条
件；培养时间以对数生长期为宜。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
第2章
酶的发酵生产
所有的生物为了维持其正常的生命活动，在一定 的条件下都能够合成其自身生长所需要的各种酶，酶 的种类和数量是受到细胞自身的严格调控的。
通过人为的操作控制，利用生物细胞的生命活动
来大规模发酵生产人们所需要的酶的技术过程，称为 酶的发酵生产。 酶的制备方法：提取法、发酵法、合成法。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
第一节 微生物产酶菌种
第二节 产酶培养基及种子培养
第三节
第四节 第五节
酶的发酵工艺控制
酶合成的调节 提高产酶发酵的措施
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
酶的发酵技术
利用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控 制发酵过程，大规模产酶的技术，称为酶的发酵技 术。内容主要包括：菌种的选育、培养基的配置、 培养条件控制、发酵方法。
第二章 酶的生物合成与发酵生产
第二章酶的生物合成与发酵生产酶工程就是将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。
酶制剂是如何生产的呢？我们知道，酶是活细胞产生的具有催化作用的生物大分子，广泛存在于动植物和微生物体内。
酶的生产方法有三种：提取分离法、生物合成法、化学合成法。
生物合成法又包括：微生物细胞发酵产酶、植物细胞发酵产酶和动物细胞发酵产酶第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成先从遗传信息传递的中心法则谈起（1958年，Crick提出）遗传信息传递的中心法则：生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代，通过RNA 转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。
DNA具有基因的具有基因的所有属性。
基因是DNA的一个片段，基因的功能最终由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。
核酸是遗传的物质基础，蛋白质是生命活动的体现者。
1970年Temin和Baitimore发现了逆转录酶，是对中心法则的补充。
即：细胞能否合成某种酶分子。
首先取决于细胞中的遗传信息载体－DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。
DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录（transcription）生成所对应的RNA，然后再翻译（translation）成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)P102DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中的过程，称为转录。
转录：见课件附图，书P102定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。
模板链（template strand）：又称反意义链（antisense strand），指导转录作用的一条DNARNA的转录过程：转录过程分为三步：起始、延长、.终止补充：原核生物的RNA聚合酶(DDRP)-见课件附图E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（α2、β、β′、）全酶（holoenzyme）包括起始因子σ和核心酶（core enzyme）。
发酵法生产酶的原理
发酵法生产酶的原理
发酵法生产酶的原理是利用微生物在特定条件下通过发酵过程生产酶。
发酵生产酶的一般步骤如下：
1. 选取适当的微生物：根据所需的酶的类型和性质，选择合适的微生物菌株。
2. 培养微生物种子菌：将选定的微生物菌株接种进含有适宜营养物质和适宜温度、pH值的培养基中，进行预培养。
3. 大规模培养：将预培养的微生物菌液接种进大规模的发酵罐中，提供足够的营养物质和良好的培养条件，如温度、pH值和氧气供应等。
4. 酶的产生和积累：在培养过程中，微生物菌株通过代谢产生有益酶的合成。
合成的酶可被菌体细胞外排出，也可积累在菌体内。
5. 分离和提取酶：发酵结束后，通过离心、过滤或其他分离方法，将菌体与培养液分离。
然后，从菌体或培养液中提取酶。
发酵法生产酶的原理是基于微生物的生物代谢能力。
微生物通过合适的营养物质和培养条件，利用糖类、脂肪和蛋白质等有机物进行代谢，产生酶作为催化剂。
这些酶能够在特定的温度、pH值和底物浓度等条件下，促进生物化学反应的进行，从而转化底物为所需的产物。
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2.通气和搅拌
在发酵过程中必须不断供给氧，一般通过供给 无菌空气来实现；
第二节 酶的发酵生产
三、微生物酶的发酵生产
（二）发酵方法 3. pH值的控制 细菌和放线菌的生长最适pH值为6.5～8.0；霉 菌和酵母的生长最适pH值为4～6；植物细胞的 生长最适pH值为5～6。
第二节 酶的发酵生产
第三节 酶的分离纯化
一、酶制剂生产的基本过程
（八）萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而 使其分离的技术。萃取中的两相一般为互不相 溶的两个液相或其他流体。按照两相的组成不 同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、 超临界萃取和反胶束萃取等。
第三节 酶的分离纯化
一、酶制剂生产的基本过程
一、酶及酶工程的概念
2．酶的特性 （1）酶催化作用的专一性强 （2）酶催化作用的效率高
（3）酶催化作用的条件温和
3．酶的分类和命名
第一节 酶工程概述
一、酶及酶工程的概念
（二）酶工程 狭义：是指在一定的生物反应器中，利用酶的 催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技 术
一、酶制剂生产的基本过程
（三）沉淀分离
第三节 酶的分离纯化
一、酶制剂生产的基本过程
（四）离心分离 （五）过滤与膜分离
第三节 酶的分离纯化
一、酶制剂生产的基本过程
（六）层析分离
第三节 酶的分离纯化
一、酶制剂生产的基本过程
（七）电泳分离 带电离子在电场中向着与其本身所带电荷相反 的电极移动的过程称为电泳。 电泳的方法很多。纸电泳、薄层电泳、薄膜电 泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电泳 。
第四章 酶工程
第一节 酶工程概述
一、酶及酶工程的概念
（一）酶 1．酶的定义 酶是具有生物催化功能的生物大分子，按照其 化学组成，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸 类酶（R酶）两大类别。蛋白酶主要是由蛋白 质组成，核酸类酶主要由核酸（RNA）组成。 目前已发现的酶有7000种以上
第一节 酶工程概述
第二节 酶的发酵生产
一、产酶菌种的筛选
（二）菌株筛选过程 主要包括以几个步骤：含菌样品的采集，菌种 分离，产酶性能测定及复筛等。
第二节 酶的发酵生产
一、产酶菌种的筛选
（三）产酶常用的微生物 1．细菌 2．放线菌
3．霉菌
4．酵母菌
第二节 酶的发酵生产
二、基因工程菌的构建
第二节 酶的发酵生产
优点：①微生物生长繁殖快，生活周期短，产 量高；②微生物培养方法简单，生产原料大多 为农副产品，来源丰富，价格低廉，机械化程 度高，经济效益高；③微生物菌株种类繁多， 酶的品种齐全；④微生物具有较强的适应性和 应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因 工程等方法培育出新的产酶菌种。
第二节 酶的发酵生产
三、微生物酶的发酵生产
（一）菌种活化与扩大培养 菌种活化与扩大培养工艺流程： 菌种（原菌）→斜面试管→小三角瓶→大三角 瓶→卡氏罐→一级种子罐→二级种子罐
第二节 酶的发酵生产
三、微生物酶的发酵生产
（二）发酵方法 1.温度的控制 枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃，黑曲霉 的最适生长温度为28～32℃。
三、微生物酶的发酵生产
（三）培养基 1. 碳源 2. 氮源
3. 无机盐
4. 生长因子
5. 产酶促进剂
第二节 酶的发酵生产
三、微生物酶的发酵生产
（四）提高酶产量的措施 1.添加诱导物 酶作用底物、酶反应产物、酶底物类似物
2.控制阻遏物浓度
3.表面活性剂
微 生 物 发 酵 产 酶 的 一 般 工 艺 流 程Biblioteka 第二节 酶的发酵生产
三、微生物酶的发酵生产
微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下， 有目的利用微生物培养来获得所生产需要的酶 制剂。微生物酶的发酵生产包括菌种活化、菌 种扩大培养、培养基制备和发酵生产等。微生 物发酵产酶的一般工艺流程如图4-1所示。
第二节 酶的发酵生产
三、微生物酶的发酵生产
（一）菌种活化与扩大培养 应用于生产时，保藏菌种必须接种于新鲜的斜面培养 基或液体培养基，在合适的条件下培养一定时间，以 恢复菌种的活力，称之为菌种活化。 活化的菌种经过种子罐扩大培养后得到的菌种称一级 菌种，可用作发酵罐大规模生产；如果生产规模非常 大，还需将菌种再扩大培养一次，称为二级菌种。
理想的宿主载体系统应具备以下几个特性：① 载体与宿主相容，携带酶基因的载体能在宿主 中稳定维持；②菌体容易大规模培养，生长无 特殊要求，且能利用廉价的原料；③所生产的 目标酶占总蛋白质的比例较高，且能以活性形 式分泌；④宿主菌对人安全、不分泌毒素。
第二节 酶的发酵生产
三、微生物酶的发酵生产
微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下， 有目的利用微生物培养来获得所生产需要的酶 制剂。微生物酶的发酵生产包括菌种活化、菌 种扩大培养、培养基制备和发酵生产等。
4.添加产酶促进剂
第三节 酶的分离纯化
一、酶制剂生产的基本过程
（一）细胞破碎
第三节 酶的分离纯化
一、酶制剂生产的基本过程
（二）酶的提取 酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂或 溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶 液中的过程，又称为酶的抽提。
酶的提取方法
第三节 酶的分离纯化
第二节 酶的发酵生产
一、产酶菌种的筛选
（一）优良菌株的标准 一个优良的产酶菌种应具备以下几点：①繁殖 快，产酶量高，生产周期短；②适应性强、易 培养和控制，便于管理和降低生产成本；③产 酶性能稳定，不易退化，不易受噬菌体侵袭； ④产生的酶容易分离纯化；⑤菌种本身和代谢 产物安全无毒，对生产人员、生产环境，酶的 应用不会产生不良影响。
广义：是指研究酶的生产和应用的一门技术性 学科，它包括酶的发酵生产、酶的固定化、酶 的化学修饰、酶反应器和酶的应用等方面内容。
第一节 酶工程概述
二、酶的发展历程
1833年 1896年 1913年 1926年 1960年 1965年 1982年 20多年来，新发现的 核酸类酶越来越多