称为酶的发酵生产
酶的生产工艺
酶的生产工艺酶是一种生物催化剂，它在许多各行各业的应用中具有广泛的用途。
酶的生产工艺是指通过生物工程技术和发酵工艺来大规模生产酶的过程。
酶的生产工艺主要包括以下几个步骤：1. 酶基因的克隆和表达：首先需要从天然菌株或其他来源中获得酶的基因。
通过核酸技术，将酶基因从DNA中克隆并插入表达载体中。
然后将表达载体转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标酶的基因。
2. 发酵培养：经过基因工程改造的细胞株能够在合适的培养条件下高效表达酶。
发酵培养是通过提供适宜的营养物质和环境条件来培养这些细胞的过程。
其中，培养基的选择、操作工艺的优化和控制等因素对酶的生产量和质量有重要影响。
3. 酶的提取和纯化：经过发酵培养后，酶可存在于细胞内、细胞外或培养液中。
提取和纯化酶的过程需要选择合适的方法，如加热处理、超声波溶解、离心、过滤、层析等。
目的是分离纯酶，并去除其他蛋白质、细胞碎片、有机物等杂质。
4. 酶的稳定化和保存：酶的稳定性对其储存和运输至关重要。
稳定化的方法包括添加保护剂、介质改良、冻干等。
此外，酶的保存过程中要注意严格的冷链管理，避免温度和湿度的变化。
5. 酶的应用：生产出的酶可用于各种行业，如食品加工、制药、酿酒、制革、纺织、洗涤剂等。
酶在这些行业中起到催化剂和增效剂的作用，提高生产效率，减少能源消耗，保护环境等。
总之，酶的生产工艺是通过基因工程技术和发酵工艺来实现大规模生产酶的过程，它涉及到酶基因的克隆和表达、发酵培养、酶的提取和纯化、稳定化和保存等多个步骤。
随着生物工程技术的不断发展，新的酶生产工艺也在不断涌现，为酶的生产提供了更多的选择和可能。
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
酶的生产方法介绍
酶的⽣产⽅法介绍
酶的⽣产是指经过预先设计，并且通过⼈⼯控制⽽获得所需要酶的过程。
概括地说，酶的⽣产⽅法有提取法、发酵法和化学合成法三种。
(⼀)提取法
提取法是最早采⽤并且⼀直沿⽤⾄今的⼀种⽅法。
提取法采⽤各种技术，直接从动植物或微⽣物的细胞或组织中将酶提取出来。
提取法虽简单易⾏，但必须要有充⾜的原材料，这就使提取法的⼴泛应⽤受到了限制。
但是，在动植物或微⽣物资源丰富的地区，提取法仍然具有应⽤价值。
例如，在屠宰⼚，可从家畜胰脏中提取胰酶；在⽔果加⼯⼚，可从菠萝⽪中提取菠萝蛋⽩酶。
(⼆)发酵法
发酵法是20世纪50年代以来⽣产酶的主要⽅法。
发酵法主要通过微⽣物发酵来获得⼈们所需要的酶。
发酵法⼀般包括固体发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和原⽣质体发酵等多种⽅式。
(三)化学合成法
化学合成法是20世纪60年代末出现的⼀种⽣产酶的技术。
1969年，美国科学家⾸次采⽤化学合成的⽅法获得了含有124个氨基酸的核糖核酸酶。
但是，化学合成法的成本⽐较⾼，并且只能合成那些已知化学结构的酶。
所以，化学合成法⽬前仍然停留在实验室内合成的阶段。
酶的发酵生产
分解代谢物阻遏
定义：容易利用的基质（常为碳源）阻遏某些酶 （主要是诱导酶）生物合成的现象。
cAMP receptor protein
第四节 酶的发酵生产技术
一、微生物发酵产酶方式
1、固体培养 利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷 壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供 微生物生长和产酶用。 浅盘法、转桶法、厚层通气法
含菌体较少，利于产品分离。 缺点：（1）不能强烈搅拌；（2）技术要求高，传质 传热效果差（氧气供给，温度控制。培养基成分的控 制）；理论研究阶段；（3）只适用于胞外酶的生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期）
优点：（1）解除细胞壁扩散障碍，可使胞内物质分泌 到胞外，变革了胞内酶的生产工艺和技术路线；（2） 可使细胞胞间质中的物质，如碱性磷酸酶等变为胞外 产物；（3）稳定性良好，可反复或连续使用。 。缺点：（1）原生质体的制备比较复杂；（2）发酵培 养基中需维持较高的渗透压；（3）要防止细胞壁再生
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第二章 酶的发酵生产
Producting Enzyme by Fermention
第一节 酶的生产方法
一、酶的生产：指经过预先设计，通过人工操 作控制而获得所需的酶的过程。 二、酶的生产方法 1、提取法：最早采用的方法，现仍继续使用。 指采用各种提取、分离技术从动、植物或微 生物细胞或组织中将酶提取分离出来。 优缺点：方法简单，有时候需先培养含酶组织 或细胞而使工艺路线变得复杂，且产品杂质 多造成分离纯化困难。
பைடு நூலகம்
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
纤维素酶 半纤维素 酶 里氏木霉、黑曲霉
木霉、曲霉、根霉
水洗布生产，饲料添加剂，消 化植物细胞壁 饲料添加剂，消化植物细胞壁， 低聚木糖生产
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
酶的发酵生产
酶工程•第一章绪论•第二章酶的发酵生产•第三章酶的分离纯化•第四章酶分子修饰•第五章酶与细胞固定化•第六章酶反应动力学•第七章酶的应用第一章绪论•第一节酶的概述•第二节酶工程概述•第三节酶的生产方法•第四节酶的应用前景第一节酶的概述一. 酶(enzyme)的概念二. 酶的研究历史三. 酶的分类与命名四. 酶的活力测定一. 酶(enzyme)的概念1.酶是催化剂（catalyst）所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。
酶在化学反应中就是充当这样的角色。
2.酶是一种特殊的催化剂3.酶是生物催化剂酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。
其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。
（1）酶具有催化的高效性酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。
如：2H2O2 2H2O + O2该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：5.6×10-4mol/mol Fe+.S、6.0×10-1mol/mol血红素.S、3.5×106mol/mol过氧化氢酶.S（2）酶具有催化的高度专一性(specificity)酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。
酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：a. 绝对专一性：酶只能催化一种反应物发生反应的特性如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。
b. 相对专一性：酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。
如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。
淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。
c. 异构专一性：酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。
西大酶工程名词解释
超临界萃取：又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。
大分子结合修饰：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称大分子结合修饰。
定点突变：是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。
是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。
反胶束萃取：是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。
反胶束又称反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。
反胶束溶液是透明的，热力学稳定的系统。
反馈阻遏作用：酶生物合成的反馈阻遏作用又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢阻遏作用：是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢和产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。
固定化酶：固定在水不溶性载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶，称为固定化酶。
固定化细胞：固定在载体上，并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。
固定化原生质体：指固定在载体上，并在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。
抗体酶：又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。
抗体酶同时具有抗体的高度特异性以及酶的高效催化能力，是通过人工设计、采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂，有些是在自然界原本不存在的。
离子交换层析：是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。
酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需酶的技术过程，称为酶的发酵生产。
酶的诱导合成：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用，简称诱导作用。
酶反应器：用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
第三章酶的发酵生产
CAP结合位点
DNA
P
O
Z
Y
A
+ + + + 转录
无葡萄糖，cAMP浓度高时
CAP CAP CAP CAP
CAP CAP
CAP
有葡萄糖，cAMP浓度低时
低半乳糖时
葡萄糖低 cAMP浓度高
高半乳糖时
RNA-pol
O Ｉ
无转录
O
mRNA
葡萄糖高 cAMP浓度低
Ｉ O
无转录
O
低水平转录
色氨酸操纵子——阻遏型操纵子 调节区
UUUU…… UUUU……
4
trp 密码子 前导肽
序列3、4不能形成衰减子结构 •当色氨酸浓度低时
细胞周期与酶的合成
可能的三种模式：
合成伴着生长进行，
进入静止期，合成降
低 静止期合成增加
中间类型
对数生长期合成降低，
三、酶发酵动力学
主要研究在发酵过程中细胞生长速率，产物 形成速率以及环境因素对速率的影响. 在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了 解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提 高酶产量具有重要的理论指导意义。
影响酶生物合成模式的因素主要是: mRNA和培养基中存的阻遏物：
mRNA稳定性高的，在细胞停止生长后继续合成相应的酶； mRNA稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成；
不受阻遏物阻遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；
受阻遏物阻遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除 阻遏,才能开始酶的合成。
2.人工合成酶制剂：
蛋白质的人工合成：人 工合成胰岛素等
人工合成酶制剂受客观
条件的限制，如试剂、 设备等，另外，体外合 成，形成单体的难度大，
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第 2章
酶的发酵生产
（2） 种子质量的控制措施
菌种稳定性检查：保藏菌种
无（杂）菌检查：显微镜观察，肉汤或琼脂斜面培养 生化分析：养分消耗速度，pH变化，溶解氧利用， 色泽，气味等
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
国内菌种保藏机构
ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所
发生退化菌种的复壮和菌种退化之前的复壮和提高。
酶工程
第 2章
酶的发养
保藏菌种 试管斜面活化 三角瓶培养
种子罐培养
2. 种子制备的过程 防止杂菌污染，减少转接次数，避免种子培养基的长
时高温灭菌；培养基及培养条件是细胞生长繁殖的最适条
件；培养时间以对数生长期为宜。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
第2章
酶的发酵生产
所有的生物为了维持其正常的生命活动，在一定 的条件下都能够合成其自身生长所需要的各种酶，酶 的种类和数量是受到细胞自身的严格调控的。
通过人为的操作控制，利用生物细胞的生命活动
来大规模发酵生产人们所需要的酶的技术过程，称为 酶的发酵生产。 酶的制备方法：提取法、发酵法、合成法。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
第一节 微生物产酶菌种
第二节 产酶培养基及种子培养
第三节
第四节 第五节
酶的发酵工艺控制
酶合成的调节 提高产酶发酵的措施
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
酶的发酵技术
利用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控 制发酵过程，大规模产酶的技术，称为酶的发酵技 术。内容主要包括：菌种的选育、培养基的配置、 培养条件控制、发酵方法。
（4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低；
（5）有利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶； （6）菌株安全可靠，非病原菌，不产毒素及其它有害物质，不 影响生产人员的身体健康； （7）基因工程菌必须符合安全性要求。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
三、菌种筛选
1. 含菌样品的采集 根据不同微生物的生态分布特点，从自然界中采样。 产酶微生物的分布基本规律：
复筛： 精确；液体或固体培养发酵，测定产酶水平。 4. 菌种的选育 诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种、基因工程育种
5. 菌种的保藏 斜面低温保藏法、沙土管保藏法、石蜡油封藏法、真空冷 冻干燥法、超低温保藏法、固体曲法等。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
6. 菌种的退化与复壮 （1）菌种退化现象：随着菌种保藏时间的延长或多次 的转接传代，菌种本身所具有的优良遗传性状发生了不利 于发酵生产的遗传变异现象。 （2）防止退化措施：创造合适的培养条件，采取有效 的菌种保藏方法，尽量减少传代次数。 （3）退化菌种的复壮：纯种分离和性能测定。包括已
（1）相近菌种产生的酶性质一般相近或相似。 （2）胞外酶的稳定性和最适条件通常和菌的最适生 长条件接近。
（3）为获得能降解某种物质的产酶菌株，一般可从 该物质分布比较丰富的地方寻找。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
2. 菌种的分离纯化
平板划线法、稀释涂布分离法
3. 产酶性能的测定 初筛： 快速、简便；平板筛选法—有色圈。
很多微生物发酵产酶的最适温度与生长繁殖的最适温
度不同，且往往低于生长最适温度。 在酶发酵生产的不同阶段控制不同的温度条件，
进行变温发酵。
调节控制 液态发酵可利用发酵罐的夹套、盘管或蛇管等通过
温（冷）水进行调节控制，固态发酵可通过通风量或风
温来进行调节。
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
3. 溶解氧对产酶的影响与调节控制 临界氧浓度——不影响细胞正常代谢的最低氧浓度
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第 2章
酶的发酵生产
接种量
与菌种特性、种子质量和发酵条件有关。 0.1 ~ 10%
种子质量的判断
细菌、酵母菌—— 菌体健壮，菌形
一致，均匀整齐，一定的排列和形态； 霉菌、放线菌——菌丝粗壮，染色力强，生长旺 盛，菌丝分枝和内含物情况良好。 种子的异常情况 菌种生长缓慢或过快，菌丝结团
酶工程
脂肪酶；理氏木霉—木聚糖酶、纤维素酶； 青霉—葡萄糖氧化酶、5/-磷酸二酯酶
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
二、产酶菌种的要求
（1）具有高产的特性； （2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，便
于管理；
（3）菌株遗传性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保 证生产的稳定性；
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
3. 种子质量的控制
（1） 影响种子质量的因素及其控制 培养基 营养成分丰富，尽可能满足细胞生长繁殖； 营养成分尽可能与发酵培养基接近；pH值稳定 培养条件 必须是菌种细胞生长繁殖的最适条件；包括 温度、pH值、通气搅拌、通风、翻曲、湿度 种龄 生命力最为旺盛的对数生长期。细菌：7~24h; 霉菌：16 ~ 50h; 放线菌：21~64h;
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
第二节、产酶培养基及种子培养
一、培养基成分对产酶的影响
1. 碳源 淀粉及其水解物
2. 氮源
无机氮和有机氮 大量元素和微量元素
氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、激素 表面活性剂、植酸钙镁、LS、聚乙烯 醇、EDTA等
3. 无机盐类
4. 生长因子 5. 产酶促进剂
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
第一节、微生物产酶菌种
一、产酶微生物的种类 1. 细菌：大肠杆菌—青霉素酰化酶、L-天冬酰胺酶；
枯草芽孢杆菌—中性蛋白酶、中温α-淀粉酶； 地衣芽孢杆菌—高温α-淀粉
2. 放线菌：葡萄糖异构酶、谷氨酰胺转氨酶 3. 酵母菌：凝血激酶、尿激酶、植酸酶 4. 霉菌：黑曲霉、米曲霉—α-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶、
二、培养条件对产酶的影响与调节控制
1. pH对产酶的影响与调节控制 细菌、放线菌：中性至微碱性；霉菌、酵母菌：微酸性 培养基pH的改变会影响产酶的种类或比例
调节控制
控制培养基的组分或比例；添加pH缓冲物种；流 加酸碱溶液或补料；提高空气流量
酶工程
第 2章
酶的发酵生产
2. 温度对产酶的影响与调节控制 不同的微生物生长与产酶的最适温度各不不同；