酶工程2 第二章：酶的发酵生产
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
《酶工程》 课后习题答案
① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或者服务于其它目的地一门应用技术。
② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或者 RNA 所拥有的酶活力单位数。
③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④ 酶活国际单位 : 1961 年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件 )下，每分钟内能转化1 μmol 底物或者催化1 μmol 产物形成所需要的酶量为 1 个酶活力单位，即为国际单位(IU)。
⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
酶的研究简史如下：(1)不清晰的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生： 1777 年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验； 1822 年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化； 19 世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684 年，比利时医生Helment 提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素(酵素)；1833 年，法国化学家 Payen 和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶； 1878 年，德国科学家 K hne 提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”(希腊文)。
(3)酶学的迅速发展(理论研究)： 1926 年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930 年，美国的生物化学家 Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
I.酶工程发展如下：①1894 年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908 年，德国的Rohm 用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911 年， Wallerstein 从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949 年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出的控制子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971 年各国科学家开始使用“酶工程”这一位词。
第二章 (酶工程)微生物发酵产酶ppt课件
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先 利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生 了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次 生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
腺苷酸 环化酶 cAMP
抑制
CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）
5'-AMP
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
C R P c A M P 复 合 物
C R P + c A M P
cAMP-CRP复合物的作用示意图
操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基 顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因（Structural gene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为 mRNA，再翻译为蛋白质。
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合 而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
第二章 酶工程
（四）发酵方法
1.温度的控制
– 枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃，黑曲霉 的最适生长温度为28～32℃。
2.通气和搅拌 – 在发酵过程中必须不断供给氧，一般通过供给 无菌空气来实现；
3. pH值的控制
– 细菌和放线菌的生长最适pH值为6.5～8.0；霉 菌和酵母的生长最适pH值为4～6；植物细胞的 生长最适pH值为5～6。
（3）粘性末端（sticky
ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
② 3’端凸出（如Pst I切点）
（4）粘性末端的意义
①连接便利 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补 就可以连接。这比连接两个平齐末端容易。
ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末 端可以连接成环形分子。
2．酶的特性 （1）酶催化作用的专一性强 （2）酶催化作用的效率高
（3）酶催化作用的条件温和
3. 酶的分类：
氧化还原酶、转移酶、水解酶、 裂解酶、异构酶、合成酶
（二）酶工程
– 狭义：是指在一定的生物反应器中，利用酶的催 化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术
– 广义：是指研究酶的生产和应用的一门技术性学 科，它包括酶的发酵生产、酶的固定化、酶的化 学修饰、酶反应器和酶的应用等方面内容。
(2)为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂
①底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部 的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳 定状态。 ②对巯基酶．可加入SH—保护剂。如巯基乙醇、GSH(谷 胱甘肽)、DTT（二硫苏糖醇)等。
第四节 分子生物学技术常用的工具酶
核酸酶类是基因工程操作中必不可少的 工具酶，基因克隆的许多DNA分子的制备、 DNA片段的切割与连接、核酸探针的标记 cDNA的合成等，都需要用一系列的功能特 意核酸酶来完成。没有酶就没有基因工程。
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
酶工程第二章微生物发酵产酶
精品医学ppt
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7
参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
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大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
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11
大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
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转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
酶的发酵生产
酶工程•第一章绪论•第二章酶的发酵生产•第三章酶的分离纯化•第四章酶分子修饰•第五章酶与细胞固定化•第六章酶反应动力学•第七章酶的应用第一章绪论•第一节酶的概述•第二节酶工程概述•第三节酶的生产方法•第四节酶的应用前景第一节酶的概述一. 酶(enzyme)的概念二. 酶的研究历史三. 酶的分类与命名四. 酶的活力测定一. 酶(enzyme)的概念1.酶是催化剂（catalyst）所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。
酶在化学反应中就是充当这样的角色。
2.酶是一种特殊的催化剂3.酶是生物催化剂酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。
其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。
（1）酶具有催化的高效性酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。
如：2H2O2 2H2O + O2该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：5.6×10-4mol/mol Fe+.S、6.0×10-1mol/mol血红素.S、3.5×106mol/mol过氧化氢酶.S（2）酶具有催化的高度专一性(specificity)酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。
酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：a. 绝对专一性：酶只能催化一种反应物发生反应的特性如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。
b. 相对专一性：酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。
如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。
淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。
c. 异构专一性：酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。
第二章 酶的生物合成与发酵生产
第二章酶的生物合成与发酵生产酶工程就是将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。
酶制剂是如何生产的呢？我们知道，酶是活细胞产生的具有催化作用的生物大分子，广泛存在于动植物和微生物体内。
酶的生产方法有三种：提取分离法、生物合成法、化学合成法。
生物合成法又包括：微生物细胞发酵产酶、植物细胞发酵产酶和动物细胞发酵产酶第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成先从遗传信息传递的中心法则谈起（1958年，Crick提出）遗传信息传递的中心法则：生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代，通过RNA 转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。
DNA具有基因的具有基因的所有属性。
基因是DNA的一个片段，基因的功能最终由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。
核酸是遗传的物质基础，蛋白质是生命活动的体现者。
1970年Temin和Baitimore发现了逆转录酶，是对中心法则的补充。
即：细胞能否合成某种酶分子。
首先取决于细胞中的遗传信息载体－DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。
DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录（transcription）生成所对应的RNA，然后再翻译（translation）成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)P102DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中的过程，称为转录。
转录：见课件附图，书P102定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。
模板链（template strand）：又称反意义链（antisense strand），指导转录作用的一条DNARNA的转录过程：转录过程分为三步：起始、延长、.终止补充：原核生物的RNA聚合酶(DDRP)-见课件附图E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（α2、β、β′、）全酶（holoenzyme）包括起始因子σ和核心酶（core enzyme）。
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分解代谢物阻遏作用：指容易利用的碳 源阻遏某些酶生物合成的现象。又称葡 萄糖效应。
分解代谢物阻遏作用
将大肠杆菌培奍在含有两种碳源（葡萄 糖和乳糖等量）的培养基里，其生长曲 线如下。
即使有诱导物存大在肠杆菌，二次生长葡萄糖不耗竭，
分解乳80 糖的酶是不会合成的。即葡 70
细菌浓度（比浊计量单位）
萄糖分60 解代谢物阻遏了β-半乳糖苷
50
酶的合40 成。早期以为只有葡萄糖才
有这种30 效应所以称葡两萄个对糖数
滞期
0
0
2
4
6
8
10
时间(小时)
分解代谢物阻遏作用的实质－cAMP调控
1 CAP(分解代谢激活蛋白）又称受体蛋白CRP 与cAMP结合才能激活DNA的转录。
主要产品
Nonozymes 有100 多种产品各行业都 有不仅提供酶产品 还有一整套的技术 支持。
10新产品发布
DANISCO
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阳经济技术开发区 ) 诺维信研发中心(北京中关村科技园区)
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诺维信（中国）生物技术有限公司位于天津经济技术开 发区，占地16万平方米，由丹麦诺维信公司投资1.65亿 美元于1994年开工兴建，1998年正式投产。是诺维信在 欧美之外最大的战略生产基地，生产范围广泛的酶制剂 产品，包括技术级、食品级、饲料级酶制剂和最先进的 洗涤剂工业用酶。产品不仅满足中国日益增长的市场需 求，还大量销往日本、东南亚、韩国和澳大利亚等国家 和地区。
腺苷酸环化酶
2 ATP
cAMP+PPi
磷酸二酯酶
cAMP＋H2O
AMP
3 葡萄糖代谢物的中间产物可以抑制腺苷酸环化 酶的活性同时增强磷酸二酯酶的活性因此大大 降低了cAMP的浓度。
特点
生产的产品种类多，应用领域广，生产 技术先进。
按应用领域分类，同一酶有多种名称， 但剂型、酶活、使用特性有所不同。
不仅提供产品而且提供术支持。
国内主要酶制剂公司
广东溢多利生物科技股份有限公司 :亚洲最大的饲 料酶制剂生产基地。
广东溢多利生物科技股份有限 公司
应用现代生物工程技术和先进的植物提取工艺， 致力于饲料添加剂、饲用药品等行业研究、开发 与生产的高科技企业。目前，已发展成为中国最 大的饲料酶制剂生产基地。
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 黑曲霉 米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉 链霉菌 啤酒酵母 假丝酵母
产酶微生物选用注意事项
菌种:非致病性的
(包括动植物致病性)
不产生毒素或生理活性物质
(例如抗生素、激素、活性肽等）
基因工程等方法选择高产安全菌株
2.4 酶生物合成的基本理论
中心法则
苏州宏达制酶有限公司
苏州宏达制酶有限公司位于 苏州太仓，占地48,000平方 米，由世界酶制剂先导诺维 信公司和苏州市宏达集团有 限公司共同投资建成。公司 采用诺维信先进的生物技术 和生产工艺制造苏宏牌系列 工业酶制剂产品，包括糖化 酶、高温淀粉酶、抛光酶、 宽温幅退浆酶、a-乙酰乳酸 脱羧酶等。产品销往全国各 地，受到广大用户的青睐。
酶生物合成的调节
转录与翻译过程都有一定的调节控制机制， 在原核生物中转录的调控占主导地位。
原核生物调控的操纵子学说
操纵子学说小结
DNA分子中存在着调节基因、启动基因（子）、操 纵基因和结构基因。
结构基因转录成mRNA后翻译成酶蛋白
启动子、操纵基因和结构基因一起称为操纵子。
RNA聚合酶结合到启动子上是酶合成的前提。
特点
剂型少，品种少，应用范围小。 生产工艺落后 企业规模小 通常只提供产品，不提供技术支持。
福建华灿生物科技有限公司
主要从事各种生物蛋白酶的研发和生产 ，包括工具酶（试剂用酶）、医药用酶 、食品用酶、饲料用酶和工业用酶等。 其中工具酶（试剂用酶）的成功生产部 分地填补了国内空白，结束了我国工具 酶长期依赖国外进口的历史
酶工程2 第二章：酶的发酵生产
2.1 酶的获取方法
提取法:动植物体。 生物合成法(发酵法)：微生物、动植物细胞。 化学合成法：结构较简单，结构清楚的酶
市场采购
科研用酶 生产用酶
常用的酶制剂公司
丹麦的
早期为诺和诺德
2000年诺和诺德公司分成隶属诺和集团的三个独立运营 公司：诺和诺德公司、诺维信公司及诺和公司。
产品展示
美国滨西法尼亚大学医学院博 士黄发灿
2.2 发酵生产简述
发酵法为主要的产酶方法
固体培养发酵
曲
液体深层发酵
固定化细胞发酵
固定化原生质体发酵 胞内酶
微生物筛选
2.3 常用的产酶微生物
产酶细胞的条件
1 酶的产量高 2 容易培养和管理 3 产酶稳定性好 4 利于酶的分离纯化 5 安全可靠
诺维信中国研 究发展中心
微生物筛选 --- 中国的真菌生物多样性中筛选新酶，。 洗涤剂工业应用 --- 面向中国和全球的洗涤剂市场，
使用各种洗衣机对洗涤剂酶进行测试。
酶制剂应用开发 --- 不断为中国市场识别和开发新的 酶制剂应用，
纺织工业应用 --- 面向全球纺织工业市场，开发新型 应用或为已有应用开发新型产品，并为现有产品提供 全面而专业的技术支持。
调节基因编码产生阻遏物。
1. 阻遏物结合到操纵基因上时阻止了RNA聚
阻遏物作用：
合酶的移动，从而阻止酶的合成。
2. 阻遏物与诱导物结合后不能再与操纵基因
结合
3. 阻遏物与辅阻遏物结合后更易与操纵基因 结合。
酶生物合成的诱导作用： 加进某种物质后，使酶合成开始或加速 度进行的过程。该物质称诱导剂。例： 乳糖诱导β-半乳糖苷酶的合成。