16SrRNA在细菌鉴定与分类中的应用

结课论文题目名称：16S rRNA 在细菌鉴定与分类中的应用学生姓名：刘*学号：*************专业：生物化学及分子生物学结业课程：系统细菌学中国·武汉2016 年12 月16S rRNA在细菌鉴定与分类中的应用刘* 2016304110***华中农业大学生命科学学院，武汉[摘要]：由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴定方法已无法准确对其进行分类鉴定。

随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水平，使人们可以通过对细菌的DNA鉴定来达到区分种属的目的。

细菌的16S 核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。

本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。

关键词：16S rRNA；细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。

大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。

20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。

在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列分析等。

这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。

特别是16S rRNA基因序列分析技术的出现，使细菌进化与否可以通过试验研究来证实。

目前，关于PCR扩增16S rRNA基因用于细菌分类和鉴定的研究越来越多，大多数细菌的16S rRNA基因均已被测序。

本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。

1.16S rRNA基因16S rRNA为原核生物的一种核糖体RNA。

目前，细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟是rRNA，其种类少，含量大(约占细菌RNA总量的80%)，分子大小适中，在漫长的生物进化过程中，其基因序列的变化非常缓慢，可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系具有良好的时钟性质；在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。

细菌中编码rRNA基因按5`.16S.23S.5S.3`方式排列的，由2个非编码的间隔区序列(InternalTranscribedSpacers，ITS)分开，5SrRNA、16S rRNA和23SrRNA3部分组成一个RNA操纵子，作为一个单位转录，再加工成为成熟rRNA。

16S rRNA是所有原核生物蛋白质合成必需的1种核糖体RNA，其具有以下特点:(1)多拷贝。

每个细菌含5～10个16S rRNA拷贝，这使得检测敏感性较高。

(2)多信息。

16S rRNA基因内部结构由可变区和保守区组成。

保守区为所有细菌所共有，可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性，可变区与保守区交错排列。

因此，可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针。

16S rRNA基因可变区所含信息的种间差异，使检测具有特异性。

(3)长度适中。

16S rRNA编码基因长度约1500bp，包含大约50个功能域。

2. 16S rRNA序列分析鉴定细菌的原理和方法通过比较各类生物16S rRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘出生物进化树。

因此，16S rRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中16S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。

2.1基因组DNA的获得首先从微生物样品中直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。

另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。

一个典型的细菌含有10000个～20000个核糖体，而基因组DNA中rrn操纵子(即rDNA 序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为1个～10个左右)，因此，rRNA在细胞中的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易于降解，RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂，一般研究多采用提取细胞总DNA，但也可根据情况选择提取rRNA。

由于rRNA在死亡的细胞中很快降解，提取rRNA通过反转录钓取16SrDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞。

2.2 16S rRNA基因片段的获得过去常常将提取的总DNA经酶切后克隆到λ噬菌体中建立DNA库，进一步通过16S rRNA通用探针进行杂交，筛选含有16SrDNA序列的克隆(鸟枪法)。

由于PCR技术的产生和发展，现在一般采用16S rRNA引物PCR扩增总DNA中的rRNA序列，或通过反转录PCR获得互补CrDNA序列后再进行分析。

采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16S rRNA序列，而且方便了后面的克隆和测序。

但也同样会出现PCR所固有的缺点，尤其是采用16S rRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增，可能出现嵌合产物(Chimericproduct)和扩增偏嗜性现象，影响结果的分析。

2.3通过16S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下3种:①将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序，与16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类，该方法获得的信息最全面，但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。

②通过16S rRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。

此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交检测，通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分布。

该方法简单快速，主要应用于快速检测，但可能出现假阳性或假阴性结果。

③对PCR产物进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)分析，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体库中的数据进行比较，分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。

3．16S rRNA可变区序列在细菌分类鉴定中的应用研究细菌16S rRNA中含有9个可变区，命名为V1~V9区。

确定某个可变区内具有细菌种特异性的序列就可能获得细菌实验室诊断的有用靶点。

除V2、V3、V4区稍长外#其他各高变区序列都很短，没有哪个高变区能区分所有细菌。

Chakravorty等对110种细菌（分别来自于人体、环境及美国疾病预防控制中心鉴定的致病菌）共113份完整的16S rRNA的V1~V8区序列进行详细研究，分别构建了基于V1~V8区序列的特异性系统树（dendrogram）。

结果显示，V1区能区分金黄色葡萄球菌与血浆凝固酶阴性葡萄球菌；V2和V3区能将除肠杆菌科以外的细菌鉴别至属的水平，V2区尤其适合于鉴别分枝杆菌属内的菌种；V3区能很好区别嗜血杆菌属内各种细菌；V6区也能区分除肠杆菌科以外的大多数菌种，特别是通过单核苷酸多态性（SNP）分析可将炭疽芽胞杆菌从与其生物学性状非常相似的蜡样芽胞杆菌群细菌中区分开来；而通过V4、V5、V7和V8区序列来鉴别细菌至属或菌种的可能性不大。

Jacob等收集了31株弗朗西斯菌属的细菌及96份临床分离株，通过对16S rRNA V1区37个核苷酸片段的PCR扩增和测序#不仅能将临床或环境标本中的弗朗西斯菌属成功鉴定出来，结合SNP分析（根据第12位核苷酸T/G不同）还可将弗朗西斯菌属的细菌分成2个组，引起人类和动物土拉热病的土拉热弗朗西斯菌（Francisella tularensis）的3个亚种均在第1组，其他几个菌种则全在第2组。

因此，该方法可快速甄别具有强传染性的土拉热弗朗西斯菌。

4.16S rRNA二级结构分析在细菌分类鉴定中的应用1981年Noller等以E.coli的16S rRNA为研究对象，综合化学修饰、蛋白结合、酶切片段等实验数据，初步推断除了16S rRNA二级结构模型，首次并对该模型的特征进行了简要描述。

Woese认为，早期对于rRNA二级结构的研究都只限于部分序列，结果并不可靠。

1983年，Woese等在原有的基础上，比较分析了真细菌域、古细菌域和真核生物域150多个物种16S rRNA全系列，详细论述了三域生物16S rRNA二级结构的特点，发现序列比较方法不但是预测假设结构的一个有力工具，而且有利于发现该分析的重要功能区段，同时指出二级结构上的改变可能导致能量变化并影响到功能。

随后，很多研究者也加入到16S rRNA二级结构的研究中来，对其模型不断改进和完善。

Neefs在1993年简述了真细菌、古细菌和真核生物的核糖体小亚基的二级结构模式图以及相互之间的主要区别，这对于以后的理论研究具有重要的参考价值和指导意义。

Wisotzkey对芽孢杆菌属（Bacillus）的16S rRNA序列进行系统发育分析，比较了16S rRNA部分同源区段的二级结构，同时结合脂肪酸类型，从中划分出一个新属：脂环酸芽孢杆菌属（Alicyclobacillus）。

国内在16S rRNA二级结构领域的研究工作起步较晚。

2003年，陈朝银等对Thermaceae科38株菌的16S rRNA序列进行了系统分析，重点研究了16S rRNA的特征性核苷酸和二级结构特征，将38株菌划分为18个种，此结果与NCBI中的分类基本一致。

郭春雷等对所分离得到的几株栖热菌属（Thermus）的菌株和该属一些有效发表进行了基于16S rRNA的系统发育分析，预测并比较了16S rRNA部分区段的二级结构，利用内环、内环与发卡环之间碱基对数目以及发卡环的碱基数目区分种间差异，证明16S rRNA二级结构可以用来区分种一级的分类单位。

陈国忠采用16S rRNA可变区二级结构图形分析，比较了姜氏菌属及几个相关属种可变区二级结构的变化。

可以将Jiangelle和其他种属彼此区分开，为姜氏菌属的建立提供了又一个有意义的分子指证。