3物理图绘制

STS是一段短的DNA序列，其长度通常为100— 500bp。一段DNA序列要成为STS需满足两个 条件： 1.它的序列必须是已知的，便于PCR检测； 2. STS必须在拟研究的染色体上有唯一的定位。
寻找STS的方法
1）从EST序列中寻找
2）SSLP
3）随机基因组序列
辐射杂种作图原理
1. STS在染色体上的位置是确定的。
限 制 性 片 段 指 纹 作 图 原 理
限制性片段指纹电泳图
指纹重叠群构建
酵母基因组遗传图与物理图的整合
3.3 染色体细胞图
细胞图：通过原位杂交的方法将基因或DNA 分 子标记定位在染色体的某一区段，由此绘制图 称为细胞图。 最常用的细胞图绘制技术为荧光原位杂交。
（fluorescent in situ hybridization , FISH）
讨论：
遗传图谱和物理图谱哪一个更加有用？
图谱的应用---定位克隆（图位克隆）
定位克隆（positional cloning）：利用遗传连锁或细 胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带 并对目的基因进行克隆。 定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗 传标记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因， 并进一步研究其功能。
思考题：
如何从单条染色体中制备出DNA克隆？3.2.2 重叠群组建相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群(contig)。 构建重叠群：步移法和指纹法
染 色 体 步 移
3.2.3 指纹作图—3种指纹
在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的方法是克隆指纹排 序。指纹指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段组成。
流式细胞仪计数仪 荧光染料对染色体 染色。 荧光探测器确定含 有正确染色体的液 滴发出的信号，并 将一个电荷加到液 滴上
Science：发现新抑癌基因SDH5
郝淮湘博士从一个功能未知的蛋白入 手，发现了一个疾病基因并阐明了其 分子功能和致病机理。 SDH5, a Gene Required for Flavination of Succinate Dehydrogenase, Is Mutated in Paraganglioma
3.1.2 限制性作图的局限
如果基因组较大，切点较多，单、双、部分 酶切的片段会很多。 限制性作图只能应用于较小的DNA分子。
大分子DNA的研究策略与方法： 1) 制备---琼脂糖包埋法 2) 酶切---稀有酶切位点限制酶 3) 分离---脉冲电泳分离
1.制备--琼脂糖包埋法
1) 分离纯化细胞核； 2) 将收集的细胞核包埋在琼脂糖 凝胶薄片中； 3) 蛋白酶消化处理细胞核。
人类21号染色体辐射杂种图
人类21号染色体辐射杂种物理图
人类基因组物理图谱: 人类基因组序列开始测定时，已有45万个EST， 其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到 49625个。再从中筛选出3万个EST、2个辐射杂交系 库（分别有83和93个细为每个标记183Kb。EST分 布结果表明，基因在染色体上的排列是不均匀的。 将物理图谱和遗传图谱整合而成更加完整的人 类基因组图谱，作为基因组测序的框架和分析的依 据。
样品→洗涤吸干水分→液氮冷冻→碾碎 →离心收集细胞核→低融点琼脂糖包埋 →蛋白酶消化→洗涤→限制酶部分酶解
插 入 大 分 子 DNA 的 分 离
载体制备与插入DNA连接
1) YAC载体： 制备过程与一般质粒载体相同。 2) BAC载体： 低拷贝载体，大量制备，超离心纯化。 3) 酶切： 释放接头，接头去磷，减少自连。 4) 连接： 将含有大分子DNA的琼脂糖薄片与载体混合, 按重量比1:1，680C保温 5 min，降温至370C， 加入连接酶过夜。
番茄抗病基因的图位克隆
定位候选克隆

该方法是定位克隆的进一步 发展。 将疾病相关基因定位于染色 体相关区域； 该染色体区域得到若干候选 基因； 进一步分析得到目的cDNA； 蛋白质功能研究。
疾 病
染色体定位
蛋 白 质 功 能
若干候选 基因
确定目 的基因
功能克隆

疾病
性状 （疾病）
细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人 工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb 的外源DNA片段。 选择标记：氯霉素抗性基因等。 BAC载体的优点： 较为稳定；没有嵌合现象； 转化效率高； 酶解后所产生的基因组DNA片段随机的 同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体 代表了某种有机体整个基因组。 1) 目标基因组大分子DNA的制备； 2) 载体制备； 3) 载体和DNA的连接； 4) 转化； 5) 转化子鉴定。
目标基因组大分子DNA的制备
3.1 限制性作图
3.1.1 限制性作图---小分子DNA
在连续出现2个或多个相同酶切位点区段，其排列 序列可有多种选择，此时采用部分酶切的办法使 该区段只发生一次酶切，这称为部分限制作图。
部分限制作图为构建完整的图谱提供了必须的信 息。但如果有多个限制位点，这种方法就显得力 不从心。特别是内部含有大小相同的片段时，重 叠的片段无法区分，使排序变得非常复杂。 一个较简单的变通策略使我们可以忽略大量的片 段。这种方法是将标记物加到要分析的DNA分子 两端，进行部分酶切处理后，很多产物成为不可 见的，我们利用可见的部分大小，确定那些未定 位的切点与DNA分子末端的相对位置。
Huai-Xiang Hao 1, Oleh Khalimonchuk 2, Margit Schraders 3, Noah Dephoure 4, Jean-Pierre Bayley 5, Henricus Kunst 6, Peter Devilee 7, Cor W. R. J. Cremers 6, Joshua D. Schiffman 8, Brandon G. Bentz 9, Steven P. Gygi 4, Dennis R. Winge 2, Hannie Kremer 3, Jared Rutter 1*
稀有切点限制酶
3 脉 冲 凝 胶 电 泳
正 交 变 电 场 凝 胶 电 泳
常 规 与 非 常 规 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳
.
均 一 脉 冲 电 泳
3.2 基于克隆的基因组作图 ---大分子DNA的克隆
基于克隆的基因组作图：根据克隆的DNA 片段之间的重叠序列构建重叠群(Contig)， 绘制物理连锁图。
定位克隆的主要目的之一是将目标基因定位于特 定染色体上。 A-1型短指（趾）症：法拉比（Farabee）1903年 在他的哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道 了这一病症，即世界上第一例孟德尔常染色体显 性遗传病，以后作为遗传学的经典例子被全世界 的生物学和遗传学教材广泛引用。
贺林等利用布依 族、苗族和汉族 的三个A-1型短 指（趾）症大家 系，对该病的致 病基因进行了精 确定位（位点定 在2q35-36区）、 克隆，并首次发 现了人IHH基因 和该基因上的三 个突变位点是导 致A-1型短指 （趾）症的直接 原因。
第三章 物理图绘制
学习要点： 物理作图的方法 各种方ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的优缺点
用遗传学技术作图对于指导基因组计划的测序
阶段还是远远不够的，因为遗传图谱的局限性： 1. 遗传图的分辨率有限：依赖于所得到的交 换数目。 2. 遗传图的精确性较低：重组热点的存在。
3. 遗传图的准确率有限：环境因素和取样误 差，分子标记的排列有时会出现差错。
YAC 载体的工作原理YAC装载的 DNA片段的大 小一般可达 200-500kb，有 的可达1Mb以上。
YAC的主要缺点： 1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两 个本来不相连的独立片段； 2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发
生缺失或重排；
3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色 体具有相似的结构; 4．转化效率低。
2. 稀有切点限制性内切酶的应用
1) 稀有切点限制酶： 在基因组DNA序列中只有很 少可识别序列的限制酶， 一般识别位点在6-8碱 基对之间, 并含有高G/C比。 2) 选用稀有切点限制酶注意事项： a) 识别位点的非特异序列，-G ANTC- (HinfI)， -GCCN4 NGCC- (BglI) b) 高等生物基因组一般A/T比较高，应选G/C 高比例限制酶，如-GC GGCCGC-(NotI) c) 基因组甲基化状态，人类基因组DNA中 5’-CG-3’的序列较少。
功能
蛋白质产 物（生物 学功能）
克隆（致病）基因的 另一种策略。 收集所要克隆的基因 的蛋白质产物及其功 能的信息，用以分离 基因，并对基因进行 定位。

染色体定 位
列
分析异常基因的产物（蛋白质），弄清它是如 何引起临床症状的： 纯化蛋白质，进行氨基酸序列测定，据此 推测可能的核苷酸序列，大部分分子病、遗传性代谢缺陷病如白 化病（albinism）、苯丙酮尿症（PKU）和镰刀形 细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采 取的这一策略。
2. 两个不同的STS出现在同一片段的机会取决 于它们在基因组中的位置，彼此接近，同 时出现在同一片段的机会就大，反之则小。
STS作图与连锁分析是一样的，不同之处仅在 于两个标记间的图距是根据分离频率来计算的。 主要采用的方法是辐射杂种作图。
辐射杂种作图的程序与方法
辐射杂种（放射杂交 体）：指含有另一种生 物染色体片段的啮齿类 细胞。
物理图谱是以物理距离来表示各遗传标记 之间或DNA序列两点之间在DNA分子上的 位置，以实际的碱基对长度来度量其物理 距离。
物理图绘制方法
1）限制性作图（Restriction mapping）： 它是将限制 性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 2）依靠克隆的基因组作图 (Clone-based mapping) ： 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群 (Contig), 绘制物理连锁图。 3）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）： 将荧光标记的探针与染色 体杂交确定分子标记的所在位置。 4）序列标记位点作图 （Sequence tagged site, STS）： 通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因 组的DNA区段中。