基因功能分析手段
基因组测序及功能解析
基因组测序及功能解析【引言】基因组测序和功能解析是现代遗传学研究中的重要技术和方法之一。
通过对生物体基因组的测序，我们可以获取关于基因组的详细信息，进而了解其组成、结构和功能。
基因组的功能解析则指的是对基因组序列进行解读和理解，以揭示基因之间的相互作用、功能和调控机制。
本文将介绍基因组测序的基本原理和方法，以及基因组功能解析的常见策略和意义。
【基因组测序】基因组测序是指对一个生物体的整个基因组进行测序，即获取其所有基因的DNA序列信息。
其基本原理是利用高通量测序技术将DNA分子断裂、重复复制、测序和组装，最终获得完整而准确的基因组序列。
目前常用的基因组测序技术有两类：Sanger测序和下一代测序。
Sanger测序是早期开发的一种经典测序方法，基于链终止和荧光标记的原理，逐个测定每个碱基的序列。
尽管Sanger测序准确可靠，但其运行周期较长、成本较高，适用于小规模基因组测序。
相比之下，下一代测序技术（如Illumina、454和Ion Torrent等）以其高通量、高效率和低成本的特点成为当前主流。
这些技术通过将DNA分子打断成片段，并在平行的DNA模板合成、扩增和测序过程中，有效提高了测序的速度和准确度。
【基因组功能解析】基因组功能解析是对基因组序列进行解读和研究，以了解基因之间的相互作用、功能和调控机制。
基因组的功能包括编码蛋白质的基因、非编码RNA等。
基因组功能解析的目标之一是鉴定和注释基因组中的基因和功能元件，以帮助我们理解基因组的结构和功能。
基因组注释是确定基因、非编码RNA以及其他功能元件如启动子、转录因子结合位点等的位置和功能。
基因组功能解析的常见策略包括基因预测、同源序列比对、基因表达分析、DNA甲基化分析等。
基因预测是通过计算机算法和生物信息学工具对序列进行比对、搜索和分析，预测出具有编码潜力的DNA序列，即基因。
同源序列比对则是将所研究生物的基因组序列与已知的功能注释良好的生物基因组进行比对，以推断序列的功能和结构。
基因组分析和基因功能注释方法
基因组分析和基因功能注释方法基因组分析和基因功能注释方法在现代生物学研究中起着至关重要的作用。
随着基因组学技术的不断进步和发展，科学家对基因组的理解越来越深入。
在这篇文章中，我将介绍基因组分析和基因功能注释方法的基本概念、技术以及应用。
基因组分析方法基因组分析是指通过对生物体基因组的研究来了解其遗传信息、结构、功能和进化。
基因组分析技术主要包括：基因组测序：通过对生物体基因组DNA的测序，可以获得其完整DNA序列。
比较基因组学：通过比较不同物种基因组之间的异同，来了解不同物种之间的亲缘关系、进化历史和基因功能的演化。
转录组分析：通过对细胞中的mRNA进行测序，来了解基因的转录过程和表达情况。
Epigenomics：研究基因表达和重编程机制，是基因组学和表观遗传学相结合的产物。
基因功能注释方法基因功能注释是指通过对基因组序列的分析和解释来了解基因的功能和作用。
基因功能注释技术主要包括：基因结构预测：通过对基因组序列进行分析，预测基因的结构、编码序列、启动子、5'和3'端以及剪接变异等基本特征。
功能注释：通过对基因组序列进行进一步分析和比较，注释基因的功能和作用，包括基因的信号序列、跨膜结构、功能域、亚细胞定位以及代谢通路等等。
基因调控网络建立：通过对基因组序列的分析和挖掘，建立基因调控网络，了解基因之间的关系与相互作用。
应用和前景基因组分析和基因功能注释方法广泛应用于医学、农业、生物技术等领域。
在医学方面，基因组分析可以用于诊断和治疗一些遗传性疾病，包括癌症、遗传性心血管病等。
在农业方面，基因组分析可以提高农作物的产量和抗病性。
在生物技术方面，基因组分析可以加速新药的开发和生物工程技术的发展。
未来，随着科学技术的不断进步和发展，基因组分析和基因功能注释方法将发挥越来越重要的作用。
预测新的基因、注释新功能域、研究新的代谢通路将成为重要的工作方向。
同时，随着大数据和人工智能技术的发展，基因组数据的处理、分析和预测将变得更加精确和快速。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
➢ 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能
存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编
植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外
源基因在转基因植株中成功表达。
➢植物中有许多转座子系统，它们的转座机
制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-
的贡献，也可列出很长的一串名单。 Bait protein。
基因功能分析的基本策略
2、双链干涉RNA的合成； 化学合成法；体外转录法
3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-
PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上 进行监测
RT-PCR Western blot
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
转基因技术存在的问题
1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基 因组功能； 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型； 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的 不稳定遗传。
二、稳定转染细胞
稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使 外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳 定表达。
RNA干涉的机制：
在植物、动物和人的细胞内存在着无活性或低活性的被 称为Dicer的由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活 Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA， 同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并 与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互 补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其 互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将 靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机 体的一种防御机制。
突变体分析与基因功能鉴定
突变体分析与基因功能鉴定突变体是指在基因组中发生的突变或变异的个体或细胞。
突变体的出现为科学家们研究基因的功能和生物体发育提供了重要的手段。
本文将介绍突变体分析的方法以及基因功能鉴定的流程和技术。
一、突变体分析的方法1. Random Mutagenesis（随机突变）随机突变是最常用的突变体分析方法之一。
它通过对生物体或细胞进行物理、化学或遗传学上的处理，引起DNA序列上的突变。
其中，化学诱变剂如EMS（乙酰甲基亚砜）或物理诱变剂如辐射等被广泛应用于随机突变的实验中。
通过这些处理，科学家能够获得大量具有不同突变类型的个体或细胞。
2. Site-directed Mutagenesis（定点突变）定点突变是通过特定的实验操作，对DNA序列中的一个或多个碱基进行有针对性的修改，从而引起特定的突变。
这种方法通常需要设计合成突变的引物，在PCR扩增的过程中使其与目标DNA序列杂交，形成突变的DNA产物。
定点突变方法广泛应用于特定基因功能区域的突变体建立以及功能研究中。
二、基因功能鉴定的流程基因功能鉴定是通过分析突变体的表型差异，推断出突变基因的功能。
下面是一般的基因功能鉴定流程：1. 突变体筛选在突变体库中，利用表型上的明显特征差异进行筛选，如落后生长，器官畸形等。
这能够帮助科学家排除表型未发生变化的个体，有针对性地选择突变体。
2. 遗传定位通过突变体的遗传追溯和染色体位点预测，确定突变位点所在的基因区域。
常用的方法有相关性分析、连锁分析和SNP标记等。
3. 候选基因鉴定综合利用遗传定位和基因组学信息，筛选出突变体可能的候选基因。
并通过进一步的功能分析，最终确定可能的作用基因。
4. 功能验证利用分子生物学、细胞生物学、生物化学等方法对候选基因进行功能验证。
例如，通过基因敲除、基因表达或突变恢复实验证明特定基因对突变体表型的影响。
三、基因功能鉴定的技术1. CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，通过设计合成特定的CRISPR引导RNA和Cas9蛋白靶向修饰基因组。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
几种常用的基因功能分析方法和工具
几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。
Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。
在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。
这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。
研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。
在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。
EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。
由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。
研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。
其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。
EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。
由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。
这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。
同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。
2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。
基因功能研究方法
反义技术的两种技术路线:
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内， 使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活，从而阻断目 标基因的表达；
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等 途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用。
反义寡聚核苷酸 与mRNA特异性结 合，阻断翻译过 程。
的部位，如球形或纤维状结构，他们介于二级结构和三级结构之间。
激活结构域:指转录因子中与转录起始复合体接触与互作的结构部
位。
优势：
它可应基因序列，它检测的相互作用在体 内发生，无需额外的纯化步骤。
删除、置换、修饰等手段重建DNA序列,使之成为靶载体； (2)将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA与胚胎干
细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列 整合到内源基因组中；
(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚，将这些囊胚 导入假孕母鼠子宫中，产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠， 进而分析被剔除基因的功能。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段，但对
于许多基因来说，简单的失活常导致令人费解的无改变 的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的 功能，但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。 基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以 确定它们是否具有相同功能。
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功能分析的结果
• 某种疾病标记基因 • 治疗某种疾病
1、分子水平 1.1 mRNA表达分析 1.2 蛋白表达分析
2、转基因验证
所有实验的设计都需 要有重复、各种对照
1.1 mRNA表达分析 1.1.1 半定量RT-PCR
实施步骤： ① RNA样品提取 ② cDNA合成（反转录） ③ 管家基因调模板浓度 ④ 目的基因PCR扩增，电泳检测看亮度
拟南芥 水稻 棉花 玉米 大豆
功能研究 绿色超级稻 抗虫棉 抗病，抗旱 抗除草剂
Thanks！
1.1.4 RNA原位杂交技术
实施步骤： ① 制备探针 ② 组织切片 ③ 原位杂交及图片分析
1.2 蛋白表达分析 1.2.1 western blot
1.2.2 免疫组化技术
实施步骤： ① 制备或购买抗体 ② 组织切片 ③ 杂交及图片分析
Байду номын сангаас
1.2.3 流式细胞术
2 转基因分析
转基因植物
1.1.2 实时定量RT-PCR（Real-Time PCR）
实施步骤： ① RNA样品提取 ② cDNA合成（反转录） ③ 稀释模板 ④ 管家基因和目的基因同时配置反应，上机 ⑤ 提取数据，进行分析
1.1.3 Northern Blot
1.1.3 基因芯片技术 公司定制芯片或者购买通用芯片 委托公司做或者自己做