真菌与细菌纤维素酶研究进展_高凤菊 (1)

第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005────────── 收稿日期：2004-10-20作者简介：高凤菊（1978-），女，河北乐亭人，四川农业大学生命科学学院硕士研究生。

- 7 -真菌与细菌纤维素酶研究进展高凤菊1，李春香2（1.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014；2.唐山师范学院 生物系，河北 唐山 063000）摘 要：对分解纤维素真菌及细菌的种类，纤维素酶的组成和分类，分子结构、作用机理，纤维素酶基因工程及研究展望进行了综述。

关键词：真菌；细菌；纤维素酶中图分类号：Q556+.2 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）02-0007-04资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。

生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t ，是人类社会赖以生存的基本物质来源。

其中90％以上为木质纤维素类物质，[1]其中的纤维素是地球上最丰富的多糖物质，[2]这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。

我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量达5.7×108t ，约相当于我国北方草原年打草量的50倍。

目前这部分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率低，还对环境造成一定的污染。

[3]随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。

在自然界中，许多霉菌[4]和细菌[5]都能产生纤维素酶，但有关细菌纤维素酶的报道很少。

由细菌所产生的纤维素酶一般最适中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。

近十几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。

[6][7][8] 1 纤维素分解微生物1.1 纤维素分解性细菌 (cellulose decomposingbacteria )纤维素分解性细菌是能分解纤维素的细菌。

由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。

这类细菌多见于腐植土中。

好氧性细菌如纤维单胞菌属（Cellulomonas ）、纤维弧菌属（Cellvibrio ）、噬胞菌属（Cytophaga ）等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。

而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium ）的细菌具有重要作用。

纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。

它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes ）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、白色瘤胃球菌（R.albus ）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens ）（程光胜 译）等。

细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。

但是细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。

碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有良好的应用价值，也成为研究热点，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属[9]。

由于酶的耐热性在生产中具有现实意义，所以耐热细菌也是研究的热点。

1.2 纤维素分解性真菌真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、疣孢漆斑菌QM460、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等[10]；丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。

真菌纤维素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。

目前饲用纤第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年第2期 - 8 -维素酶的生产多采用真菌，其中木霉纤维素酶产量高、酶系全，故而被广泛应用。

2 纤维素酶的组成及分类纤维素酶是一种多组分的酶系，采用各种层析、电泳等技术可将纤维素酶分成不同的组分。

此酶指的是能降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键的一类酶的总称，因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。

纤维素酶的组成与分类有两种主要的分类形式。

第一种分类方法是根据各酶功能的不同主要分为三类：（Ⅰ）葡聚糖内切酶（EC3.2.1.4，1，4-β-D-glucan glucanohydrolase 或endo-1，4-β-D-glucanase ，来自于真菌简称为EG ；来自于细菌简称为Len ），此酶又称Cx 酶（Cx enzyme ）、CMC 酶（羧甲基纤维素酶）（carboxymethyl cellulase ），缩写为EC ：3。

（Ⅱ）葡聚糖外切酶（1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase 或exo-1，4-β-D-glucanase ，EC3.2.1.91，来自于真菌简称Cbh ；来自于细菌简称Cex ），此酶又称C 1酶（C 1enzyme ）、微晶纤维素酶（avicelase ）、纤维二糖水解酶（cellobihyddrolase ），缩写为：CHB ：2。

（Ⅲ）β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21，β-1，4-glucosidase 或glycosidase ），又称为纤维二糖酶（cellobiase ），缩写为：BG ，这类酶将纤维二糖和短链纤维寡糖水解成葡萄糖分子。

对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。

该酶的专一性差，实际上可作用于所有的葡萄糖β-二聚物。

[11]第二类通常认为主要包括C 1酶、C X 酶和β-葡萄糖苷酶。

C 1酶主要作用天然纤维素，将其转变成水合非结晶纤维素；C X 酶又可分为C X1酶和C X2酶，C X1酶是内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1，4-葡萄糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖，C X2酶为外断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子的非还原性末端作用于β-1，4-葡萄糖苷键，逐步切断β-1，4-糖苷键生成葡萄糖。

纤维二糖酶又称β-葡萄糖苷酶，其作用于纤维二糖，生成葡萄糖。

这些酶协同作用可将纤维素彻底降解为还原糖——葡萄糖。

[12][13] 3 纤维素酶的分子结构纤维素酶分子是由球状的催化结构域Catalytic Domain （CD ）通过一个富含脯氨酸或羟基氨基酸的连接桥（Linker ）和没有催化作用纤维素结合结构域，被称为Cellulose Binding Domain （CBD ）三部分组成。

纤维素酶分子的催化结构域（CD ），主要体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。

内切酶的活性位点位于一个开放的裂口（cleft ）中，它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。

外切酶的活性位点位于一个长环状通道中，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。

纤维素结合结构域（CBD ）在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接桥与催化结构域相连。

纤维素结合结构域不具备水解纤维素的功能，但有助于纤维素酶与底物的结合，它的三维结构极其复杂，对酶的催化活力起决定作用。

人们推测，CBD 可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBD 上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链从纤维素表面脱离开来，以利于催化区的水解作用。

但有一些纤维素酶并没有CBD ，如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体(celluosome)吸附纤维素的。

CBD 执行着调节酶对可溶和非可溶性底物专一性活力的作用，对酶的催化活力是非常必需的。

CBD 是一面亲水，另一面疏水的楔形结构，能插入和分开纤维素的结晶区，在其吸附于纤维素分子链表面后，酶分子连接到纤维素上，可能提高了底物表面有效酶的浓度，或者可能促进了纤维素表面单个葡聚糖链的增溶溶解，具有疏解纤维素链的作用。

不同的CBD 以不同的拓扑学结构与结晶纤维素结合，都具有相似的刚性支柱结构，以便进行识别和结合所需的侧链能正确定位。

[14]连接桥（Linker ）是一段相当长、高度糖基化的连接肽，此区大多富含脯氨酸和羟脯氨酸，它的作用可能是保持CD 和CBD 之间的距离；有助于同酶分子间形成较为稳定的聚集体。

[15]虽然真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大，但它们的催化区在一级结构上氨基酸数量和三维结构上的大小却基本一致。

但它们的Linker 和CBD 却存在明显的差异。

真菌和细菌来源的纤维素酶的CBD 的三维结构也得到了解析，真菌CBD 由33－36个氨基酸组成，且具有高度的同源，而细菌由100－110个氨基酸组成，同源性较低。

真菌的外切酶的CBD 的结构形状呈“楔型”，一面亲水，另一面疏水；结构中芳香族氨基酸只有3个Tyr ，它们位于平坦的亲水面，执行吸附纤维素的功能；细菌外切酶的CBD 很大，且包含很多芳香族氨基酸，它们中的Trp54和Trp72暴露于蛋白分子表面，执行吸附功能。

细菌纤维素酶linker 富含Pro 和Thr ，完全由Pro-Thr 这样的重复顺序组成，而真菌的纤维素酶linker 富含Gly ，Ser 和Thr 。

不同维素酶linker 的糖高凤菊，李春香：真菌与细菌纤维素酶研究进展- 9 -基化程度和糖链也不同，糖化不是纤维素酶活力所必需的。

在高级结构的分子形状上，细菌纤维素酶CD 与CBD 夹角为135°；真菌纤维素酶CD 与CBD 夹角为180°[17][18][19]。

有限酶切时，真菌纤维素酶只具有一个酶切位点，在靠近CD 与连接桥边结区，酶切时可将CBD 与连接桥一并切去；而细菌的外切酶具有两个酶切位点，有限酶切时，可将CBD 和连接桥分别切去。

[15]4 纤维素酶对纤维素的作用机理1950年，Reese 等曾阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C 1—Cx 假说。

其中C 1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区，使氢键破裂，呈无定形可溶态，再由Cx 催化它们形成纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。