产纤维素酶细菌的筛选及培养
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究⼴西轻⼯业GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY2009年7⽉第7期（总第128期）⾷品与⽣物纤维素是地球上分布最⼴，含量最丰富的碳源物质，对⼈类⽽⾔，它⼜是⾃然界中数量最⼤的可再⽣资源，是永不枯竭的⽣物资源。
纤维素可被纤维素酶降解⽣成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应⽤是植物质资源再利⽤的主要途径。
微⽣物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，迄今为⽌，国内外共记录了产纤维素酶的菌株⼤约53个属的⼏千个菌株[1]，其中主要有细菌、放线菌和真菌，⽬前研究的最清楚的是霉菌中的⾥⽒⽊霉T.reesei 。
细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，⼤多数对结晶纤维素⽆降解活性，且所产⽣的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度[1]，因此对细菌的研究较少。
但由细菌产⽣的纤维素酶⼀般为中性或碱性，近⼗年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤、纺织等⽅⾯应⽤前景⼴阔，细菌纤维素酶制剂已显⽰出良好的应⽤性能和巨⼤的经济价值[2]。
我们从青藏⾼原牦⽜粪中分离到⼀株⾰兰⽒阴性菌Ti-bet-YD4600-2，经16S rDNA 序列⽐对分析，Ti-bet-YD4600-2为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.)菌株。
鞘氨醇单胞菌属是Yabuuchi （1990）[3]等通过研究16S rDNA核苷酸序列，胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q 的主要类型，确定的⼀个新属，该属细菌具有着极强的⽣命⼒，分布⼴泛，对除草剂、偶氮染料、多环芳烃等具有较好的降解作⽤，近年来受到⼴泛重视和研究[4]。
１材料和⽅法1.1材料来源通天河（34°49.753N,92°56.142E ）海拔4604m 处取牦⽜粪样品。
1.2培养基[5]分离平板培养基，复筛培养基，滤纸崩解实验培养基，液体摇瓶培养基。
1.3初筛取样品1g 置于装有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶中，摇匀，从三⾓瓶中取1mL 转移到另⼀盛有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶，在25℃和150r /min 下振荡培养2h ，取0.1mL 振荡培养液涂布筛选到以CMC 为唯⼀碳源的培养基平板，倒置恒温25℃培养3~4d ，注意观察菌的⽣长情况，挑取单菌落⽤斜⾯保存。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。
常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。
2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。
3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。
二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。
常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。
2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。
3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。
三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。
2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。
3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。
4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。
综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。
通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。
纤维素酶产生菌CMC-Z的筛选及产酶条件的优化
纤维素酶产生菌CMC-Z的筛选及产酶条件的优化郑虹【摘要】用刚果红染色羧甲基纤维素钠平板筛选方法,从土壤中筛选到一株具有高效产纤维素酶的菌株CMC-Z,经菌落形态观察及镜检,初步鉴定为放线菌.采用单因素及正交设计等试验对CMC-Z培养基、发酵条件进行了优化,碳源、氮源最佳添加量分别为可溶性淀粉1%、明胶2%;最佳发酵条件：接种量7.5%,培养基初始pH 7.0,装量100 mL,培养温度30℃,培养时间72 h.通过方差和极差分析,表明影响菌株CMC-Z纤维素酶产生的因素主次顺序为：可溶性淀粉浓度〉初始pH〉装量〉明胶浓度〉接种量〉温度〉发酵时间.经优化后,其酶活可达到38.37 u.mL-1.%A cellulase-producing strain was isolated by the congo red dying method on the culture plates which has sodium carboxymethyl eellulase. The stain was identified as Actinomycete. The maximum activi- ties of carboxymethyl cellulase enzyme of CMC-Z were increased via series single factor and orthogonal comparisons. The optimal culture medium and conditions for enzyme production by CMC-Z were obtained. The optimum of carbon source and nitrogen source were soluble starch 1% and gelatin 2% , pH of culture medium 7.0 ; inoculum rate 7.5% , culture temperature at 30 ℃, fermentation time for 72 h. The results of range analysis and variance analysis showed that the order were the soluble starch 〉 pH 〉 loading capacity 〉 gelatine 〉 inoculum size 〉 temperature 〉 fermentation time. The maximum activities of CMC was 38.37 u · mL-1 under the optimized fermentation conditions.【期刊名称】《闽江学院学报》【年(卷),期】2012(033)005【总页数】6页(P114-119)【关键词】纤维素酶;筛选;正交设计【作者】郑虹【作者单位】福建师范大学福清分校生物与化学工程系,福建福清350300【正文语种】中文【中图分类】Q503植物纤维是地球上丰富的可再生资源，但由于降解难，大多数都没有得到很好的利用［1－3］，研究报道通过纤维素酶可将工业上废弃的纤维素转化为有机肥料、单细胞蛋白、酒精等物质［4－5］，逐渐成为饲料、食品、洗涤剂、纺织等行业的新能源，因此如何开发和利用纤维素是当今世界的热门课题.研究报道，能降解纤维素的微生物［6］种类很多，真菌有绿色木霉［7］、灰绿曲霉［8］、木霉、根霉［9］等，细菌有芽孢杆菌［10］、放线菌［11］等.本试验从土壤中筛选到一株高产纤维素酶的菌株CMC-Z，并对其产酶条件进行了优化，期望应用于饲料行业，作为饲料用酶.1.1.1 土壤福建师范大学福清分校后山的土壤.1.1.2 培养基①羧钾基纤维素钠液体培养基：CMC-Na 1.5 g，NH4NO33.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO34.10 g，H2O 100 mL，琼脂2 g，pH 自然;②斜面培养基：葡萄糖2 g，蛋白胨0.2 g，酵母膏0.3 g，(NH4)2SO40.5 g，H2O100 mL，琼脂 2 g，pH 7.0;③刚果红培养基：(NH4)2SO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO40.1 g，NaCl 0.05 g，CMC-Na 2 g，刚果红0.02 g，H2O100 mL，琼脂2 g，pH7.0;④发酵培养基：KH2PO40.5 g，明胶2.0 g，CMC-Na 1.9 g，MgSO40.25 g，H2O 100 mL，pH 7.0.1.2.1 纤维素酶产生菌的筛选取0.5 g土样接种于CMC-Na液体培养基进行富集培养，30℃、180 r·min－1振荡培养48 h，将菌液(稀释度为 10－6、10 －7、10－8)涂布于羧甲基纤维素培养基平板，30 ℃培养箱培养 48 h.挑取单菌落点接于刚果红培养基平板上，30℃ 培养72 h.选择菌落周围红色沉淀多的菌株为试验菌株.1.2.2 纤维素酶活力测定取4支经过灭菌的EP管，然后编号，并向1号试管中加入没有经过发酵的培养1.0 mL，作为空白对照;其他3根试管加入有经过发酵的培养液各1.00 mL.然后8 000 r·min－1离心5 min，各取上清液0.25 mL加到事先预热5 min的纤维素钠试管溶液中，编号分别为1、2、3、4，其中1号作为空白.溶液充分混匀，放在40℃水浴中保温30 min后取出，立即向1、2、3、4号试管中各加入0.5 mL DNS以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至5 mL.以1号试管溶液为空白对照调零点，在540 nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果.根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出 CX 酶活力(u·mL－1)［7］：在上述条件下，算出1 mL酶液在40℃，pH 4.6条件下每分钟水解纤维素生成1 μmol葡萄糖的量.1.2.3 菌株CMC-Z产酶条件的优化1)碳源对纤维素酶产量的影响300 mL三角瓶装量100 mL添加有2%碳源的发酵培养基，接种量5%，30℃180 r·min－1振荡培养72 h后，测发酵液中纤维酶活力.试验用的碳源有CMC-Na、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖.2)氮源对纤维素酶产量的影响300 mL三角瓶装量100 mL添加有2%氮源的发酵培养基，接种量5%，30℃180 r·min－1振荡培养72 h后，测发酵液中纤维酶活力.试验用的氮源有蛋白胨、酵母膏、尿素、NaNO3、NH4Cl、明胶.3)发酵时间对纤维素酶产量的影响300 mL三角瓶装量100 mL发酵培养基，接种量5%，30℃180 r·min－1振荡培养，从开始培养起，每隔8 h取样测纤维酶活力.4)培养温度对纤维素酶产量的影响300 mL三角瓶中装入100 mL添加有2%可溶性淀粉及2%明胶的发酵培养基，接种量5%，分别于25、30、35、40 ℃，180 r·min－1振荡培养 72 h.测发酵液中纤维酶活力.5)培养基初始pH对纤维素酶产量的影响300 mL三角瓶中装入100 mL添加有2%可溶性淀粉及2%明胶的发酵培养基，将pH分别调至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，121 ℃灭菌 20 min.接种量5%，30 ℃ 180 r·min－1振荡培养72 h.测发酵液中纤维酶活力.6)摇瓶装液量对菌株CMC-Z产酶能力的影响300 mL三角瓶中装入添加有2%可溶性淀粉及2%明胶的发酵培养基，装量分别为50、75、100、125、150 mL，pH 7.0，接种量5%，30℃ 180 r·min－1振荡培养72 h.测定发酵液中纤维酶活力.7)正交设计在发酵条件单因素优化的基础上，进行7因素3水平的正交设计，因素包括可溶性淀粉浓度、明胶浓度、发酵时间、培养温度、培养基初始PH、装量、接种量等. 以上试验均进行3个重复平行试验.采用EXCEL与DPS软件进行数据统计分析，比较结果用平均值加标准差表示.以羧甲基纤维素钠为底物，刚果红染色法筛选到一株高产纤维素酶产生菌，命名为CMC-Z，该菌株菌落为白色，边缘不整齐，呈放射状.镜检形态为连线状的，无细胞核.初步鉴定为放线菌.如图1.2.2.1 不同碳源对菌株CMC-Z产酶的影响不同微生物对碳源的吸收和利用是有差别的，菌株CMC-Z对不同碳源的利用及产酶能力也是有一定差异的.结果如图2所示.由图2可见，培养基中添加2%可溶性淀粉或CMC-Na，菌株CMC-Z纤维素酶产量高于添加乳糖、蔗糖或葡萄糖，可能因为该菌株所产的纤维素酶是属于诱导型分泌，在含有纤维素和半纤维素的培养基中，该酶会被大量诱导产生;而添加有底物的培养基，酶的诱导会受到抑制，从而导致产酶量不高.2.2.2 不同氮源对菌株CMC-Z产酶的影响菌株CMC-Z对不同氮源的利用及产酶能力也是有一定差异的.结果如图3所示.由图3可见，培养基中添加2%明胶，菌株CMC-Z产酶量最高为20.68 u·ml－1，培养基中添加其他氮源，菌株CMC-Z产酶量均在10～15 u·ml－1之间.CMC-Z产生的纤维素酶，不仅受其培养基成分的影响，而且也受培养条件的影响，如时间、温度、培养基的初始pH、装液量等.2.3.1 培养时间对菌株CMC-Z产酶的影响微生物代谢产物的积累是一个动态的过程，不同的时间产生不同的产物，同一产物又是随着时间的拉长而发生增减的变化，对菌株CMC－Z进行发酵时间的试验，结果见图4.由图4可见，菌株CMC-Z产纤维素酶活力随着发酵时间的拉升呈先升后降的趋势，发酵时间为72 h时产酶量达到最大40 u·mL－1.2.3.2 温度和装量对菌株CMC-Z产酶的影响放线菌能够合成和积累很多种产物［12］，不同温度及装量下所积累的产物种类及产量也有所不同，对于菌株CMC－Z积累纤维素酶的温度和装量试验结果分别见表1、表 2.由表1、表 2可见，菌株CMC-Z产酶量随发酵温度及装量均呈先升后降的趋势.当发酵温度为30时，产酶量达到最大 34.19 u.ml－1.当装液量为75 mL时，产酶量达到最大 17.14 u.ml－1.因此，菌株最适产酶量的温度为30℃，菌株最适产酶量的装量为75 mL.2.3.3 培养基初始pH对菌株CMC－Z产酶的影响微生物在不同pH培养基中，合成的产物也会有所差别.培养基初始pH对菌株CMC－Z产酶的试验结果见图5.微生物在不同pH培养基中，其产物的合成和积累是有差异的，试验结果表明，随着pH的变化，纤维素酶先增加，pH达到7.0时，产酶量达到最高，接着，纤维素酶产量逐渐下降.2.3.4 接种量对菌株CMC－Z产酶的影响将接种量分别设为5%、7.5%、10%、12.5%、15%进行产酶试验，摇床发酵测定酶活力，结果见图6，表明菌株在接种量为7.5%时产酶量最高.菌株CMC-Z进行了单因素试验条件的优化后，为了综合考虑各因素对菌株产酶量的影响，进行了可溶性淀粉浓度、明胶浓度、发酵时间、温度、初始PH、装量、接种量等7因素3水平的正交试验.试验设计及结果见表3、表4、表 5.由表3、表4结果可见，可溶性淀粉添加量对菌株CMC-Z产酶量影响最大，其次是初始pH，接下来依次是装量、明胶添加量、接种量、温度，最后是发酵时间.最后确定菌株 CMC-Z产酶最佳工艺条件是A1B2C2D2E2F2G2.经优化后，其酶活可达到38.37 u·mL－1.同时，由表4方差分析可知，试验的7个因素的F比值均小于F临界值(3.740)，因此这些因素对菌株CMC-Z产酶量的积累均无显著性差异，但可溶性淀粉的添加量却是菌株CMC-Z产酶量最主要的影响因素.以CMC-Na为唯一碳源从枯枝中筛选到一株纤维素酶产生菌CMC-Z，经菌落观察及镜检，初步鉴定为放线菌.通过碳源、氮源及发酵条件的优化，确定放线菌CMC-Z产酶最佳碳源、氮源的最佳添加量分别为：可溶性淀粉1%，明胶2%.适宜的发酵工艺条件：培养基初始pH为7.0，培养温度为30℃，接种量为7.5%，装量为100 mL，发酵时间为72 h.经发酵条件优化后，菌株产酶量可达到38.37 u·mL－1，比未优化前提高了3.73倍.方差和极差分析，表明影响菌株CMC-Z纤维素酶产生的因素主次顺序为：可溶性淀粉浓度＞初始pH＞装量＞明胶浓度＞接种量＞温度＞发酵时间.【相关文献】［1］周红霞，江海涛，张红琳，等.纤维素分解菌的分离筛选和产酶条件优化［J］.南京晓庄学院学报，2010，11(6)：37－40.［2］陈丽燕，张光祥，黄春萍，等.两株高产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及酶学特性［J］.微生物学通报，2011，38(4)：531－538.［3］张涛，皮雄娥，刘伟，等.纤维素降解菌的筛选和鉴定［J］.现代食品科技，2010，26(4)：418－420.［4］马旭光，张宗舟.微生物降解农作物秸秆生产SCP饲料的研究进展［J］.资源开发与市场，2010，26(7)：624－626.［5］冀春雪，杜风光，史吉平，等.纤维乙醇用纤维素酶的研究进展［J］.酿酒科技，2007(7)：118－121.［6］胥成浩，农向.选育纤维素酶产生菌的国内外研究新进展［J］.农家之友，2010，10：124－125.［7］林英，秦萍，杜志强，等.产纤维素酶绿色木霉F-UV264产酶条件优化［J］.安徽农业科学，2006，34(11)：2 312－2 314.［8］徐昶，龙敏南，邬小兵，等.高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究［J］.厦门大学学报：自然科学版，2005，44(1)：107－111.［9］宋颖琦，刘睿倩，杨谦，等.纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究［J］.哈尔滨工业大学学报，2002，2(34)：198－201.［10］张立静，李术娜，朱宝成.高效纤维素降解菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T-7的筛选、鉴定及降解能力的研究［J］.中国农学通报，2011，27(7)：112 －118.［11］邵继海，胡俊林，孙留敏，等.一株产耐热纤维素酶放线菌的固体发酵研究［J］.饲料工业，2006，24(27)：37－39.［12］周德庆.微生物学教程［M］.北京：高等教育出版社，1999：39－41.。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展纤维素是由纤维素素和半纤维素组成的天然高分子化合物，在工业和生活中具有广泛的应用。
纤维素酶是一种专门分解纤维素的酶，在纤维素利用和生物质转化等领域有着广泛的应用前景。
本文综述了产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展。
一、产纤维素酶菌的筛选和鉴定目前，已有许多研究对产纤维素酶菌进行筛选和鉴定，其中常用的方法包括传统的分离培养方法、高通量筛选系统和基于基因组的筛选方法等。
1.传统的分离培养方法传统的分离培养方法通常包括从不同的环境样品中分离出细菌，并对其进行酶活性测定。
通过该方法已经成功分离出具有纤维素酶活性的微生物，例如Clostridium sp.、Bacillus sp.、Cellulomonas sp.、Acidothermus cellulolyticus等。
2.高通量筛选系统高通量筛选系统是一种快速且高效的筛选方法，常用于从大量的微生物中沉淀出目标细菌。
常用的高通量筛选方法包括微流控装置、免疫分离、荧光筛选和高通量发酵等。
3.基于基因组的筛选方法基于基因组的筛选方法是一种新的筛选方法，它能够根据基因组数据精确地预测目标细菌的性能和代谢特性。
通过依据基因组组态图，可以预测细菌所需的碳水化合物、氮素源、维生素和微量元素等。
并通过基因搜索和蛋白质分析，可以确定特定的酶基因并对其进行驯化研究。
二、纤维素酶菌的改良方法针对传统纤维素酶菌的低效率和耐受性差等问题，研究人员采用不同的改良方法提高纤维素酶的效率和性能。
常用的改良方法包括基因工程技术、筛选和驯化适应性强的菌株、应用生物物理方法提高纤维素酶的结构稳定性等。
1.基因工程技术基因工程技术是一种常见的改良方法，它通过基因重组或突变来优化目标细菌的代谢功能。
例如，利用多肽链替换可以改变纤维素酶的空间结构，提高酶的催化能力。
基因重组还可以将来自不同细菌的多个酶基因组合，形成多功能细菌产生多种酶的机构，提高纤维素降解效率。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展引言：纤维素酶是一类能够降解纤维素的酶，能够将纤维素水解成可溶性的糖类物质。
这种酶类在生物能源、生物制造等领域具有重要的应用价值。
产纤维素酶的菌种及其筛选改良方法的研究，对提高纤维素降解效率、降低生产成本、推动生物能源利用具有重要意义。
本文将介绍产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展。
一、产纤维素酶菌的分类和特点产纤维素酶的菌种多样，主要包括真菌和细菌两大类。
真菌包括木霉属、曲霉属、青霉属等；细菌则主要包括纤维素降解细菌和纤维素生产细菌等。
产纤维素酶菌的特点主要表现在对纤维素的降解效率和产酶条件的适应性上。
一方面，有些产纤维素酶的菌种能够高效降解纤维素，产酶量大，并且在生长环境下对温度、pH等条件的适应性较强，能够在广泛的生境中生长；有些产纤维素酶的菌株则对产酶条件相对苛刻，需要较为特殊的生产条件。
二、产纤维素酶菌的筛选方法为了提高产纤维素酶菌的降解效率和提高其生产水平，需要对产纤维素酶菌进行筛选和改良。
在筛选产纤维素酶菌的过程中，可以通过以下几种方法进行：1. 采用纤维素为唯一碳源的筛选培养基。
利用富含纤维素的培养基，能够筛选出对纤维素降解能力较强的菌株。
2. 通过间接检测法筛选。
可以利用纤维素水解产生的可溶性糖类物质来间接检测纤维素酶的产生情况，从而筛选出产酶量较高的菌株。
3. 利用分子生物学方法筛选。
通过利用特定基因的特异性引物，进行PCR扩增和RFLP分析，还可以利用荧光原位杂交技术等手段，对产纤维素酶的菌株进行筛选和鉴定。
4. 通过连续培养或连续发酵系统，对菌株进行长期的驯化和培养，增加产酶菌株的产酶能力。
三、产纤维素酶菌的改良方法在筛选出具有较高产酶能力的菌株之后，需要对这些菌株进行改良，以提高其产酶能力和降解效率。
产纤维素酶菌的改良方法主要包括以下几种：1. 通过传统的诱变选择法，对产纤维素酶菌株进行诱变处理，产生新的突变型菌株，以提高产酶效果。
一株产纤维素酶细菌的筛选与发酵产酶试验
纤维素酶是一种多组分的复合酶系，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三种组分组成。
由于纤维素在自然界广泛分布，很多细菌、放线菌、酵母和霉菌都具有降解纤维素的能力。
此前纤维素降解菌的研究多以霉菌为主，而对细菌的研究着力较少。
近年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，通过细菌发酵生产纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。
本文拟从土壤中筛选出产纤维素酶的细菌并进行初步鉴定，以期为纤维素酶制剂的生产提供可能的细菌菌种。
一、材料与方法1.材料（1）土壤样品。
从南京科技职业学院校园小树林堆放枯枝和落叶处采集腐殖土土样，五点取样，混匀，放入无菌的袋中备用。
（2）富集培养基。
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，加水至1000mL，调pH7.0-7.2。
（3）初筛培养基。
羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5g，(NH4)2SO44g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨1g，琼脂15g，加蒸馏水至l000mL，pH自然。
（4）复筛培养基。
CMC-Na 2g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，刚果红0.4g 琼脂15g，加蒸馏水至l000mL，pH自然。
（5）液体发酵培养基。
CMC-Na 10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，NaCl 5g，KH2PO4 1g，加蒸馏水至l000mL，灭菌后用无菌Na2CO3溶液调pH至10。
2.方法（1）土壤细菌的富集。
称取土样10g，放入装有玻璃珠和90mL无菌水的锥形瓶中，充分振摇。
取5mL悬液放入含45mL富集培养基的250mL锥形瓶中，37℃，150r/min振荡培养一昼夜。
（2）初筛培养基稀释涂布。
将富集后的土壤细菌培养物进行梯度稀释，取10-4,10-5,10-6三个稀释度各0.1mL于初筛培养基平板上进行稀释涂布，37℃倒置培养一昼夜，得到单菌落。
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
ｄ ｉ ３ ６／ｉ ｎ１７ － ０ Ｘ２ １．１ ０ ５ ｏ：ｍ．９９ ．ｓ． ４ ５ ６ ． ００ － ０ ｉｓ ６ ０
丢糟 ，是在 固态 发 酵法 酿造 白酒 时 入窖 回糟 蒸 酒后 的酒醅 。 由于 丢糟含 有难 于消 化 的稻壳 ， 粗纤 维
素 的酶解 是 一个 复 杂 的过 程 ，其 真正 的酶解 机 制还 不 完全 清楚团 。 从 自然 中分 离 出 的纤 维 素 酶生产 菌纤维 素 酶活 力 一直 不 高 ， 了最 大 限度 的利 用丢 糟 中的 纤维 素 ， 为
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ａ ｄ Ｍ ｕ ａ ｅ ｅ ｉ ｆＨｉ ｈ Ｃｅｌ ｌ ｓ ｔ ｉｙ Ｓ ｒ ｉ ｃ ｅ ｎ ｎ ｎ ｔ ｇ ｎ ｓｓｏ ｇ ｌ ａ ｅ Ａｃｉ ｔ ｔ ａ ｎ ｕ ｖ
Ｆ Ｎ ｈｎ －ｉｇ Ｙ Ｎ ａ－ ａ ， Ｉ Ｎ Ｚ ｉｗ ｉＬ ｉ － ｉｎ ， ＨＥ ｏ ｂｎ Ａ Ｇ Ｓ ａ ｇ ｌ ， Ａ Ｇ Ｄ ｎ ｄ ｎ Ｑ Ａ ｈ－ ｅ， Ｉ ａ ｑａ ｇ Ｃ Ｎ Ｍａ－ ｉ ｎ Ｘ ｏ
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产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【摘要】通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料.采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定.结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).%In order to provide bacteria for development of cellulase preparations and cellulase engineering,the high-yield cellulase bacteria strains were screened.Separate cellulase producing strains isolated from cow or sheep dung and putrid maize straws or wood chips with Congo red plate to screen cellulase producing strains through the determination of enzyme activity with DNS assay,and observe its shape,dyeing and cultural characteristics.16S rDNA universal primers were applied to amplify genomic DNA of the strain,and to identify the species of rescreening strains.The result indicated that the isolated 16 bacterial strains with higher cellulase production were gram positive,short rod and central spores.In which,10 strains were Bacillus subtilis,6 strain were Bacillus amyloliquefaciens.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】6页(P7-11,19)【关键词】纤维素酶;16SrDNA;分离;鉴定;枯草芽孢杆菌;解淀粉芽孢杆菌【作者】吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【作者单位】甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q939.99随着世界经济的快速发展，能源需求量急剧上升，为了实现可持续发展，世界各国均在寻求新的替代能源，如风能、核能、太阳能、生物质能等等。
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产纤维素酶细菌的筛选及培养
一、筛选步骤
1、菌种的采集
采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。
2、菌种初筛
（1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。
将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。
（3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）加入1号试管，加无菌水。
混匀后吸取加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。
（4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液于CMC 培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。
（5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。
（6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。
（7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。
（8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。
3、菌种复筛
（1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min 下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。
二、培养方法
1清洗实验器具
2灭菌
3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基）
4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床）
5稀释菌样
6涂布平板或平板划线
7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了
8观察记录（数量、分布等）
三、培养基种类及其组成
1、初筛
CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25 g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。
刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0.5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。
无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL，加棉塞与CMC培养基一起灭菌20 min。
另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。
2、复筛
基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO419，MgSO4 0．29，Nacl 10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min
3、培养
纤维素培养基:硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钠0.5g，纤维素粉20.0g，刚果红0.2g，琼脂20.0g,在，25℃条件下灭菌。
宋扬
生技1212
06。