产纤维素酶的筛选汇总.
高产纤维素酶菌的筛选Doc1
纤维素酶高产菌株选育研究进展指导老师：梁智群学生：郭法谋班级: 08级发酵工程学号: 0813303002纤维素酶高产菌株选育研究进展郭法谋（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005）摘要：纤维素酶在经济上的可行性主要是受到纤维素酶成本的限制,因此筛选出产高活性纤维素酶的菌株是开发利用纤维素资源的前提和关键。
本文总结了纤维素酶高产菌选育的国内外研究进展，以及诱变育种、原生质体融合技术育种、纤维素酶基因克隆的国内外研究现状，对今后纤维素酶高产菌的选育研究发展趋势做了全面的分析和综述。
关键词：纤维素酶；诱变育种；原生质体融合；基因克隆Mutation Breeding of Cellulase HighProducing StrainGUO Famou(College of Life Science and Technology Guangxi University Nanning530005 China)Abstract:The cost of the cellulase is the mainly restrictions if it is viability in the economic, Therefore, screening high activity cellulase producing strain is a prerequisite and key resources for development and utilization of cellulose.This paper summarizes the bacteria breeding high-yield cellulase research at home and abroad, as well as mutation breeding, protoplast fusion breeding, gene cloning cellulase research at home and abroad In the current,for future high-yield cellulase Breeding Research and Development has done a comprehensive analysis of trends and synthesis. Keywords:cellulase；breeding; Protoplast fusion; Cloning纤维素酶在饲料、酿造、粮食加工、果汁与蔬菜加工、纺织等各个方面都具有重要的用途。
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究⼴西轻⼯业GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY2009年7⽉第7期（总第128期）⾷品与⽣物纤维素是地球上分布最⼴，含量最丰富的碳源物质，对⼈类⽽⾔，它⼜是⾃然界中数量最⼤的可再⽣资源，是永不枯竭的⽣物资源。
纤维素可被纤维素酶降解⽣成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应⽤是植物质资源再利⽤的主要途径。
微⽣物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，迄今为⽌，国内外共记录了产纤维素酶的菌株⼤约53个属的⼏千个菌株[1]，其中主要有细菌、放线菌和真菌，⽬前研究的最清楚的是霉菌中的⾥⽒⽊霉T.reesei 。
细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，⼤多数对结晶纤维素⽆降解活性，且所产⽣的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度[1]，因此对细菌的研究较少。
但由细菌产⽣的纤维素酶⼀般为中性或碱性，近⼗年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤、纺织等⽅⾯应⽤前景⼴阔，细菌纤维素酶制剂已显⽰出良好的应⽤性能和巨⼤的经济价值[2]。
我们从青藏⾼原牦⽜粪中分离到⼀株⾰兰⽒阴性菌Ti-bet-YD4600-2，经16S rDNA 序列⽐对分析，Ti-bet-YD4600-2为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.)菌株。
鞘氨醇单胞菌属是Yabuuchi （1990）[3]等通过研究16S rDNA核苷酸序列，胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q 的主要类型，确定的⼀个新属，该属细菌具有着极强的⽣命⼒，分布⼴泛，对除草剂、偶氮染料、多环芳烃等具有较好的降解作⽤，近年来受到⼴泛重视和研究[4]。
１材料和⽅法1.1材料来源通天河（34°49.753N,92°56.142E ）海拔4604m 处取牦⽜粪样品。
1.2培养基[5]分离平板培养基，复筛培养基，滤纸崩解实验培养基，液体摇瓶培养基。
1.3初筛取样品1g 置于装有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶中，摇匀，从三⾓瓶中取1mL 转移到另⼀盛有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶，在25℃和150r /min 下振荡培养2h ，取0.1mL 振荡培养液涂布筛选到以CMC 为唯⼀碳源的培养基平板，倒置恒温25℃培养3~4d ，注意观察菌的⽣长情况，挑取单菌落⽤斜⾯保存。
纤维素酶的筛选
纤维素酶高产菌株的分离筛选基地一班王木兰 201630123017一、研究意义21世纪，人类面临的最主要的挑战就是资源与环境问题，生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用产物达1.5x1011 ~2.0x1011t，是人类赖以生存的基本物质来源，其中纤维素是地球上最丰富的物质之一，然而这部分资源尚未得到充分开发利用，目前主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，利用率低，对环境污染严重。
纤维素酶的研究为纤维素更有效利用开辟了一条新途径，纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据其作用方式可分为外切β-1，4-葡聚糖苷酶、内切β-1，4-葡聚糖苷酶和β-1，4-葡萄糖苷酶3类，在这三种酶协同下，纤维素最终被完全降解为葡萄糖。
研究表明纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织和造纸等领域有广阔的应用前景。
利用纤维素酶降解天然纤维素，对于解决世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。
但目前纤维素酶的生产存在着酶活力低，生产周期长等问题，还未能真正应用于大规模工业生产，因此选育具有高酶活的纤维素分解菌株成为关键之一。
二、国内外研究动态目前获得纤维素酶高产菌株主要是通过自然界选育、诱变育种以及利用基因工程技术改造菌株。
其中，研究较多的是通过对已知纤维素产生菌进行诱变，以增加产酶微生物菌种，提高酶活力。
迄今为止，产纤维素酶能力最强的是里氏木霉，它是产纤维素酶和半纤维素酶最主要的工业生产菌种，国内外已有很多这方面的报道，1971年，Mandels等通过绿色木霉QW60获得了产酶活力提高一倍的QW9123；上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉，经物理、化学诱变，获得了高活力的菌株Ea3-967和N2-78。
纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌和真菌中发现分离纤维素酶系，迄今为止，据报道已经有近100多纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆表达。
产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定
种类繁多 ， 来源也很广 。大多数纤维 素酶 主要来 自 微 生物 体 心 。 目前 ， 们 对 各 种 微 生 物 （ 括 真 菌 ］ 人 包 和细菌 ） 的纤 维 素 酶 的关 注 较 多 ， 其 是 源 于 真 菌 尤 的纤维素酶 。所有能分解微 晶纤维素 的真菌 ， 能 均 或 多或 少地 分泌 纤 维 素 酶 ， 以纤 维 素酶 的真 菌 源 所
本 研究 使用 羧 甲基 纤维 素 液体 培养 基 富集 培 养 环境 样 品 ， 分离 得到 ３ 产 纤维 素酶 的霉菌 。使 用 ４株 刚果 红染 色 初筛 和 Ｄ Ｓ法 复筛 ， 到 ２株纤 维 素 酶 Ｎ 得 活较 高 的霉 菌菌 株 ｗ０ ０ 、 ｘ０ ５ 同时还 使 用 苏 ｘ５ ３ ｗ ｌ０ 。
℃培养 ４ —５ ｄ进 行 活 化 ， 后 接 种 到 ３ Ｌ（ ５ 之 ０ｍ ２ ０
ｍＬ三角瓶 ） Ｄ Ｐ Ａ液体 培养 基 中 ， ２ ℃ 、８ ／ ｉ 于 ８ １０ｒｒｎ ａ 下 摇床 发酵 ， ３ｄ后 取 样 测 定 上 清 发 酵 液 中 的 Ｃ ＭＣ
酶 活力 。
１ ５ ＤＮ ． Ｓ法测 Ｃ ＭＣ酶 活
—
ｆ ｕ ｅｈｌｓ ｏ ｒｃ ｌ ａ ｅ—ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｆ ｎ ｉｓ ａｎ ｒ ｓ ｌ ｔｄ ｔ ｒ ｕ ｈ ｅ ｒ ｈ ｎ ｕ ｔ ｒｎ ｙ ＣＭＣ —Ｎａ ｌ ｕ ｄ ｍｅ ｉ ｍ． ｒ ｄ ｃ ｎ ｇ ｔ ｉ ｓｗｅ ｅ ｉｏａ ｅ ｈ ｏ ｇ ｎ ｃ ｍｅ ｔｃ ｌ ｉ ｇ ｂ ｕ ｒ ｉ ｕ ｉ ｉ ｄ ｕ ｑ
Ｄ Ｉ１．９９ｊ ｉ ｎ １０ － ８ ．０ １０ ．０ Ｏ ： ３６／．ｓ ．０ ９ ８ １２ １．３０２ ０ ｓ ４
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定一、采样地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化二、培养基：（1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。
（2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。
20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。
（均需要加入抗生素100μg/ml）产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。
1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。
0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。
刚果红染液：2% 刚果红溶液。
NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。
三、实验方法3.1 真菌菌株的分离取土样方法如前所述。
取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展【摘要】本文主要介绍了产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展。
首先解释了纤维素酶的作用与应用，然后介绍了不同种类产纤维素酶菌的特点以及筛选方法。
接着讨论了如何改良产纤维素酶菌的培养条件和优化生产工艺。
最后分析了研究的重要性，探讨了未来研究方向，并进行总结。
通过本文的介绍，读者可以了解到产纤维素酶菌及其改良方法在生物工程领域的重要性和潜在应用，为相关领域的研究提供了启示和指导。
【关键词】产纤维素酶菌、筛选、改良、纤维素酶、菌种、特点、培养条件、生产工艺、研究进展、重要性、未来方向、总结。
1. 引言1.1 产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展产纤维素酶是一类能够降解纤维素的酶，能够将纤维素分解成可利用的小分子糖类，具有重要的应用价值。
随着生物技术的发展，人们对产纤维素酶菌及其筛选改良方法进行了深入研究，取得了一系列进展。
产纤维素酶菌是产生纤维素酶的微生物，包括细菌、真菌和放线菌等。
不同种类的产纤维素酶菌具有不同的特点，如生长速度、纤维素酶产量和适应环境等。
筛选出高效的产纤维素酶菌对于提高纤维素降解效率至关重要。
在筛选产纤维素酶菌的过程中，常采用的方法包括传统的筛选培养基、色谱技术、PCR技术等。
通过这些方法，可以快速有效地筛选出具有高产酶能力的菌株，为纤维素降解的研究和应用提供了有效的渠道。
改良产纤维素酶菌的培养条件也是提高纤维素酶产量的重要途径。
调节温度、pH值、碳源和氮源等因素，可以显著提高产酶菌株的酶活力和产酶量。
在优化产纤维素酶的生产工艺方面，通过对发酵过程中各项参数的精细调控，可以大幅提升纤维素酶的产量和活力，实现经济效益和环境友好的纤维素降解过程。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究对于开发和利用纤维素资源具有重要意义。
未来的研究方向应该围绕提高产纤维素酶菌的酶活力、稳定性和产酶量展开，以满足不断增长的纤维素降解需求。
通过不懈的努力和创新，相信产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究将迎来更加美好的发展前景。
(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.
目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
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(7) .测定诱变后菌株的透明圈并将其菌株发酵测其酶活 力。
(8).菌株生长及产酶特性测定:活化菌株接种CMC发酵培 养基，接种量5％，30℃、200rpm下培养，定时取样测定 培养液的OD600和CMC酶活力，观察菌株生长和产纤维素 酶情况，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。优化菌株的 培养条件，对3-12的pH值条件以及25-37℃温度条件下菌 株生长也进行观察。
二.试验目的
目前，酸性纤维素酶主要用于纤维素的水解糖化， 而碱性纤维素酶则广泛用于洗涤工业。不过，至 今所研发的纤维素酶仍存在酶活力不足等问题， 有必要挖掘新的酶资源。
三. 技术路线
产纤维素酶菌株的初筛
产纤维素酶菌株的复筛
诱变育种 测其透明圈及酶活力
优化产酶菌株的培养条件
制备酶液
产高活性纤维素酶菌株的鉴定
(5).菌株生化鉴定:采用Biolog 微生物鉴定系统进行。操作按仪 器的说明书进行。
(6).诱变育种：
●制备孢子悬液：取试管斜面，用无菌水洗下孢子，装入带 玻璃珠的三角瓶中，27℃振荡2-3h，用脱脂棉过滤后，以10倍 稀释法作一系列稀释，挑选一个稀释度，用移液管移l ml饱子 悬液到小塑料离心管中，待用。
研究进展：
该类酶上世纪40年代首次被发现。早期发现的纤维素 酶主要由丝状真菌的木霉、根霉等菌种产生，通常为酸 性 酶其最适作用pH值在3-5，在碱性条件下基本没有酶 活或活力很低。上世纪70年代，在嗜碱性的枯草芽孢杆 菌(Bacillus sp. N-4 和 Bacillus sp.1139 菌株)中发现了最 适作用pH在碱性范围的纤维素酶，即碱性纤维素酶。随 后发现芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces) 的数十株嗜碱性菌株均能够产生碱性纤维素酶，此外， 动物源碱性纤维素酶开始被报道，并成为开发碱性纤维 素酶的重要方向。
(9). 酶液制备:活化菌株接种CMC发酵培养基30℃、200 rpm培养48 h，取培养液，4℃，4000 rpm离心10 min，取 上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4℃，10000 rpm离 心10 min，收集沉淀，加入培养液同体积的pH值8.0，0.1 mol/L的Tris-HCL缓冲液溶解，４℃保存，用于测定酶的 活力，2 d内使用。
(3).仪器:菌种鉴定96孔板
2.方法
(1).菌株初筛：取样品1 g，加10 mL无菌蒸馏水，充分 振摇，静止30 min，取上清液稀释105倍，涂布接种 CMC-刚果红平板筛选培养基，30℃培养72 h至菌落长 出，挑取透明水解圈较大的菌落。
(2).菌株复筛：挑取透明水解圈较大的菌落，接种 CMC液体发酵培养基，37℃、200rpm摇瓶培养24 h， 测定培养液的碱性CMC酶活力，选取活力最高的培 养瓶，取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基 培养，纯化菌种３次，最后得到产碱性纤维素酶的 高产菌株，命名，斜面和冷冻干燥保藏。
(11).比较诱变菌株与原菌株的酶活力。
(12).绘制菌株生长曲线与产酶曲线图:以最适的pH, 温度 条件培养产酶菌株，每隔4 h 取一次发酵液，测定OD600 值与纤维素酶活力，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。
(10).酶活力测定:以CMC钠盐为底物，测定CMC酶活力。 酶 反应体系 含粗酶液 0.5mL， CMC钠 盐 1%(g/ mL)， 0.1mol/L的Tris-HCL(pH值为8.0)缓冲液2.0 mL。50℃水 浴反应60 min，立刻用DNS法测定CMC水解所释放的葡 萄糖量。以作用CMC钠盐底物1min释放1 mg葡萄糖所 需的酶量定义为１个酶活力单位。
●紫外(UV)诱变方法：距离紫外灯30cm左右照射60s、70s、 80s、90s、100 s，并不断摇动。
● 硫 酸 二 乙 酯 (DES) 诱 变 方 法 : 分 别 吸 取 1ml 孢 子 悬 液 10ulDES(终浓度为1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料离心管中， 于30℃水浴振荡45min、60min、75min，处理完毕后加入30ul 25%的硫代硫酸钠溶液终止反应。
测定酶活力
比较两种菌株酶活力 菌株形态观察 菌株分子鉴定 菌株生化鉴定
绘制菌株生长曲线和产酶曲线图 确定产纤维素酶菌株的属种
测定CMC酶的最适作用条件
四.试验方法
1. 材料和仪器
(1).用于菌株分离的样品采自畜禽堆肥。
(2).所用培养基：LB培养基、CMC-刚果红平板筛选培
养基、CMC液体发酵培养基、Bug培养基
主讲人：何 园 学 号：2014103015 时 间：2014.11.13
1. 研究背景
讲 2. 试验目的
解 3. 技术路线
内 容
4. 试验方法 5. 预期效果
6. 参考文献
一.研究背景
纤维素作为地球上最丰富的可再生有机资源，其转化和 利用对解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有 十分重要的意义。纤维素酶是能够作用于纤维素底物β1,4葡萄糖苷键的一类生物酶的总称。由于开发利用木质 纤维资源对人类社会的今后发展具有重大意义，而纤维 素酶对纤维素资源的开发起到极为关键的作用，对其研 究一直是国内外的热点。纤维素代谢也是地球生物圈碳 素循环的重要组成部分，寻找和开发高产纤维素酶菌种 ，是充分利用纤维素资源的关键。
(3).菌株的形态观察：LB培养基培养的菌体用革兰 氏染色，显微镜观察菌株形态。
(4). 分 子 鉴 定 ： 提 取 菌 体 DNA(CTAB 法，PCR扩增菌株的 16SrRNA序列。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测、分离， 然后用Agarose Gel DNA Purification Kit 试剂盒切胶回收， 用T4 ligase连接到Pmd-18T载体上。将带有目的片段的载 体通过转化E.coli DH 5α菌株扩增培养后，选择阳性克隆 提取质粒测序。将测序得到的16S rRNA序列用NCBI的 BLAST2.0进行同源分析，搜索Genebank核酸数据库，根 据比对结果对菌株进行分子鉴定。